Dosage de la phosphatase dans les cellules du CRC : une méthode pour examiner l’état de phosphorylation de la protéine tau dans les cellules cancéreuses colorectales

Résumé

Source : Huda, M. N., et al. Dosage de la phosphorylation et de la liaison des microtubules ainsi que de la localisation de la protéine tau dans les cellules cancéreuses colorectales. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo décrit un protocole d’évaluation de l’état de phosphorylation de la protéine tau par un dosage de la phosphatase dans les cellules cancéreuses colorectales. L’enzyme phosphatase agit sur les groupes phosphate présents sur la protéine tau, augmentant la mobilité de la protéine tau sur le gel SDS PAGE par rapport aux échantillons de protéines tau non traités.

Protocole

1. Dosage de la phosphatase

1. Traitez les lysats cellulaires lorsque les cellules atteignent une confluence de ~65 % (approximée à l’aide de la microscopie), retirez le milieu supplémenté en MEM et ajoutez du MEM sans sérum avec de la curcumine 5 μM, 10 μM et 30 μM ou 25 mM, 50 mM et 100 mM LiCl. Incuber à 37 °C pendant 24 h dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂, 24 h après le traitement, laver les cellules avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée et gratter les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire. Transférez les cellules raclées dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL et centrifugez pendant 4 min à 1 800 x g à 4 °C pour obtenir des granules de cellules. Lyser les cellules en suspendant les pastilles dans 100 μL de tampon RIPA complet à 4 °C pendant 20 min tout en tapotant régulièrement les tubes. Soniquez brièvement les échantillons. Centrifuger l’homogénat de la cellule dans une centrifugeuse de paillasse à 22 570 x g pendant 20 min à 4 °C. Transférez les surnageants dans d’autres tubes marqués à l’aide d’une pipette) avec de la phosphatase alcaline dans le tampon de phosphatase alcaline.
   1. Pour les échantillons témoins et les échantillons traités, préparer des échantillons de 20 μL contenant 20 μg de protéines totales. Ajoutez le volume de lysats cellulaires contenant 20 μg de protéines totales, suivi de 2 μL de tampon de phosphatase alcaline et de 10 μL de phosphatase alcaline. Ajouter de l’eau distillée pour compléter 20 μL.
2. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 1 h. Arrêter la réaction en ajoutant de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à une concentration finale de 50 mM, ou en ajoutant de l’orthovanadate de sodium (Na₃VO₄) à une concentration finale de 10 mM. La réaction peut également être arrêtée en chauffant à 75 °C pendant 5 min.
3. Avant la fin de l’incubation des échantillons contenant de la phosphatase, préparer des échantillons de la même concentration sans ajouter de phosphatase pour les comparer avec des échantillons traités à la phosphatase.
4. Ajoutez le tampon de chargement de gel 4X SDS fraîchement préparé contenant 400 mM de DTT.
5. Incuber les échantillons sur un bloc de chaleur à 100 °C pendant 5 min. Mélanger les échantillons à l’aide d’un vortex. Laisser refroidir à température ambiante pendant ~10-15 min.
6. Assemblez un système d’électrophorèse pour faire fonctionner un gel de polyacrylamide à 10 % par SDS-PAGE.
   1. Chargez 10 μg de protéines (13 μL d’échantillon) par puits sur un gel de polyacrylamide à 10 %. Chargez l’échelle de poids moléculaire.
   2. Après avoir chargé l’échantillon, connectez les électrodes positive et négative du système d’électrophorèse à une source d’alimentation pour maintenir une tension constante. Au départ, commencez à 70 V pendant 20 minutes pour déplacer les échantillons de protéines du gel d’empilement dans le gel de résolution. Ensuite, augmentez la tension à 125 V et faites fonctionner le gel pendant environ 70 à 120 minutes jusqu’à ce que les échantillons et l’échelle de protéines atteignent la fin du gel.
   3. Une fois l’électrophorèse terminée, transférez le gel sur une membrane PVDF à l’aide d’un système d’électrobuvardage humide. Transfert pendant ~100 min à 100 V.
   4. Marquez la tache en faisant une petite entaille sur le côté de l’échelle de poids moléculaire. Utilisez une feuille de plastique transparente et un cutter bien aiguisé pour couper le tache.
7. Bloquez la membrane dans un tampon de blocage BSA à 4 % pendant 90 min à température ambiante.
8. Incuber le transfert dans une solution d’anticorps primaires (anti-tau à 1:5 000) à 4 °C pendant la nuit. Lavez la tache au PBST quatre fois, pendant 7 minutes chacune.
9. Préparez la solution d’anticorps secondaires appropriée (IgG anti-souris de chèvre à 1:5 000) et incubez le transfert pendant 90 min à température ambiante. Laver au PBST quatre fois, pendant 7 minutes chacune.
10. Développer le transfert à l'aide d'un kit de chimiluminescence selon les recommandations du fabricant. Recouvrez la tache d’une pellicule plastique transparente. Acquérir des images par un système d’imagerie par chimiluminescence pour la chimiluminescence avec un logiciel approprié.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellule HCT 116	ATCC	CCL-247
Plat de 100 mm	Corning	430161
MEM (EBSS)	Hyclone	SH30024.01
Sérum fœtal bovin (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	Conserver à -20 °C
Anticorps anti-Tau 13	Abcam	AB19030
Dithiothreitol (DTT)	Roche	Tél. : 10 708 984 001	Température de stockage 2–8 °C
curcumine	Sigma-Aldrich (Fluka)	Référence 78246	Température de stockage 2–8 °C
Anticorps anti-Tau (phospho S396)	ABCAM	AB109390
FastAP Phosphatase alcaline thermosensible	Thermo Scientific	EF0651	Conserver à -20 °C
PMSF	sigma	P7626	Conserver à température ambiante
Cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase	Signalisation cellulaire	Référence 5870	Conserver à 4 °C
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Signalisation cellulaire	Référence 5871	Conserver à 4 °C
Anticorps IgG secondaire anti-souris de chèvre	ThermoFisher	A-11005	Conserver à 4 °C dans l’obscurité
Dodécylsulfate de sodium (FDS)	Affymetrix	Référence 75819
Imageur moléculaire	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Conserver à 4 °C
Tampon RIPA	sigma	R 0278	Température de stockage 2–8 °C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X - 100	Conserver à environ 25 °C
Membrane PVDF	Bio-Rad	Référence 162-0177
Anticorps IgG secondaire anti-souris de chèvre	ThermoFisher	A-11005	Conserver à 4 °C dans l’obscurité
Dodécylsulfate de sodium (FDS)	Affymetrix	Référence 75819
Réactif de colorant pour le dosage des protéines	Bio-Rad	Référence 500-0006
Démantailleurs sonique	Fisher Scientific	Modèle 500
Centrifugeuses de microlitres	Hettich Zentrifügen	MIKRO 200 R