Molécules simples à l'imagerie du transport nucléaire

Résumé

Microscopie à molécule unique Approche fourni de nouvelles connaissances sur le transport nucléaire.

Résumé

L'utilité des approches molécule unique microscopie par fluorescence a été prouvée pour être d'un grand résultat dans la compréhension des réactions biologiques au cours de la dernière décennie. L'enquête sur les interactions moléculaires à haute résolution spatiale et temporelle profonde au sein des cellules est resté difficile en raison de la faiblesse inhérente des signaux provenant de molécules individuelles. Des travaux récents par Yang et al. démontré que la microscopie à champ étroit épifluorescence permet la visualisation de transport nucléocytoplasmique au niveau molécule unique. Par l'approche seule molécule, cinétique importante, comme le temps de transport nucléaire et l'efficacité, pour les molécules de fret signal dépendantes et indépendantes ont été obtenues. Ici, nous avons décrit un protocole pour l'approche méthodologique avec une meilleure résolution spatio-temporelle des nm et 12 ms 0.4. L'amélioration de la résolution nous a permis de capture de transitoires de transport actifs et des événements de diffusion passive à travers les complexes des pores nucléaires (NPC) en semi-intactes les cellules. Nous prévoyons que cette méthode soit utilisée dans l'élucidation d'autres événements de liaison et le trafic intérieur des cellules.

Protocole

1. Préparation du système de pile pour l'expérience seule molécule

1. Au moins une semaine à l'avance, commencer une nouvelle culture de la lignée cellulaire HeLa à partir d'un stock par décongélation à 37 ° C et mettre dans un flacon de ^culture de 25 cm2 avec les médias de 5 ml, incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO ₂ incubateur pendant 24 heures et de le diviser au moins 3 fois afin de fournir une condition optimale pour les cellules. Toutefois, les cellules ne doivent pas être divisé plus de 20 fois à cause de la propension de leurs taux de croissance de ralentir de manière significative. Des cellules HeLa ont été préalablement ....

Discussion

Des précautions doivent être prises pour assurer une bonne colocalisation des molécules NE et unique au cours de l'expérience. Il est également important de fournir un rapport signal bruit de haute, surtout lorsque le signal est faible en raison de mauvais étiquetage ou de photoblanchiment. Précision de localisation est limitée par le bruit de fond (découlant de sortir du flou de fluorescence, bruit de lecture du CCD, sombre facteurs actuels et d'autres).

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