Nous présentons ici l'injection intracrânienne de vecteurs AAV pour le marquage fluorescent des neurones et cellules gliales dans le cortex visuel.
Abstract
L'injection intracrânienne de vecteurs viraux pour exprimer une protéine fluorescente est une technique de marquage polyvalent pour la visualisation des sous-ensembles spécifiques de cellules dans différentes régions du cerveau in vivo et dans les sections du cerveau. Contrairement à l'injection de colorants fluorescents, l'étiquetage virale offre ciblant des types cellulaires individuels et est moins coûteux et fastidieux que d'établir des lignées de souris transgéniques. Dans cette technique, une viraux adéno-associés (AAV) est injecté par voie intracrânienne en utilisant les coordonnées stéréotaxique, une micropipette et une pompe automatique pour la livraison précise de l'AAV à la zone désirée avec un minimum de dommages aux tissus environnants. Paramètres d'injection peuvent être adaptées à des expériences individuelles en ajustant l'âge des animaux à un taux d'injection, l'emplacement d'injection, le volume d'injection, d'injection, AAV de sérotype et le promoteur dirigeant l'expression des gènes. Selon les conditions choisies, viro-induit l'expression du transgène peut permettre la visualisation des groupes de cellules, des cellules individuelles ou d'une amende de processus cellulaires, jusqu'au niveau des épines dendritiques. L'expérience montre ici représente une injection de double-brin AAV exprimant la protéine fluorescente verte pour l'étiquetage des neurones et cellules gliales dans le cortex visuel primaire de souris.
Protocol
1. Manipulation du virus et le stockage Une protection adéquate et des techniques de manipulation doivent être choisis en fonction du niveau de biosécurité du virus à être utilisé. Ces pratiques peuvent être trouvés dans la biosécurité dans les laboratoires ème édition microbiologique et biomédicale 5, disponible sur le site du CDC ( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). L'utilisation de ve…
Discussion
Livraison de gènes médiée par Virally détient un grand potentiel pour l'étude des processus neurologiques et le traitement des troubles du cerveau 1,2,3. La grande polyvalence de cette technique peut aussi être exploitée pour marquer les cellules par fluorescence pour l'imagerie in vitro et in vivo4. Ici nous démontrons une procédure détaillée pour la transduction de neurones et cellules gliales dans le cortex visuel de la souris en utilisant un double brin d&#…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été rendu possible par des subventions du NIH (EY012977), une bourse de carrière dans les sciences biomédicales de l'Burroughs Wellcome Fund, la Fondation de Whitehall, et la Sloan Foundation (AKM).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor
Stoelting
51625
Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm
Fine Science Tools
14084-08
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved
Fine Science Tools
11152-10
Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled
Fine Science Tools
11251-35
Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm
Fine Science Tools
11000-12
Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece
Ram Products, Inc.
TECH2000ON/OFF
Dental drill
Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter
Fine Science Tools
19008-14
Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul
VWR International/ Drummond
5-000-1001 or 53480-287
Mineral oil
VWR International
29447-338
Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)
World Precision Instruments, Inc.
M3301-M3-R
Used for determining stereotaxic co-ordinates
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller
World Precision Instruments, Inc.
UMP3-1
Sutures
VWR International
95056-952
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Sutter Instruments
P-97
Tobradex
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