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1. Préparation des réactifs
- Préparer la préparation du tampon de dissection en ajoutant les composés suivants: 128 mM de NaCl, 1 mM EGTA, 4 mM de MgCl2, 2 mM de KCl, HEPES 5 mM, et 36 mM de saccharose en 1000 ml, pH à 7,2 et stériliser par filtration.
2. Préparation de la dissection
- Cube Siligard: Le gel est coupé à environ un pouce de largeur, 1 cm de long et environ 1cm de haut. Le cube de gel est placé sur une lame de verre lors de la dissection. Cubes peuvent être utilisés plusieurs fois.
- Pins: Pins utilisés pour la dissection doit être extra court. La partie inférieure forte de broches minutien fonctionne mieux dans la dissection.
- Besoin d'une paire de ciseaux pointus de printemps de microdissection.
- Besoin deux beaux pince à pointe.
3. Collecte des larves
- Errant 3 e stade larvaire qui sont expression d'une protéine GFP vésicules marquées sont recueillies sur une boîte de Pétri.
- Les larves sont lavées à l'eau déminéralisée pour se débarrasser de tous les aliments.
4. Une dissection en direct des larves
- Une larve est transféré au cube de gel de dissection sur une lame de verre. Larve est immergé dans un tampon de dissection.
- Larve se languissait à l'antérieur et postérieur au moyen de deux broches fines avec la face dorsale en place.
- Avec des ciseaux de microdissection, une petite incision est faite sur la ligne médiane à proximité de l'extrémité postérieure. A partir de cette incision une coupe est faite par le biais à l'antérieur. En utilisant deux broches, la broche la cuticule couper sur les bords latéraux.
- Ajouter une goutte de dissection tampon. Retirer délicatement le tube digestif, les intestins et corps gras avec une pince. La plupart de ces tissus normalement suinter pendant la coupe dorsale.
- Remplacer le tampon avec un tampon de dissection douce. La larve ne doit jamais être sec et doit être constamment à disséquer tampon.
- Les incubations utilisant des marqueurs in vivo ou Mitotracker Lysotracker sont faites à cette époque, en diluant l'un marqueur in vivo dans un tampon de dissection. Après l'incubation des marqueurs in vivo dans le lavage de la larve disséquée à plusieurs reprises (5 lavages rapides) à l'aide du tampon frais de dissection.
- Après avoir remplacé le dernier lavage pousser les goupilles dans les syligard et immédiatement lamelle. Les larves est maintenant prêt pour l'observation.
5. Imagerie en temps réel des larves disséquées
- Placez la lamelle et gel sur la platine du microscope et de l'image à l'aide d'un microscope inversé.
- Nous utilisons un objectif 100x à des vésicules Tagged Image au sein des larves nerfs segmentaires. Expression de la GFP dans les corps cellulaires du ganglion ventral est d'abord évaluée avant que les nerfs segmentaires sont imagés. Si coloration GFP robustes est observée dans les corps cellulaires dans le ganglion ventral, les nerfs sont ensuite numérisés et utilisés pour l'évaluation.
- En utilisant un système Dual View avec des filtres pour CFP / YFP ou DP / YFP et logiciels affichage fractionné, nous pouvons simultanément image en deux protéine marquée in vivo.
6. Les résultats représentatifs
Figure 1:. Une image représentative montrant de nombreuses vésicules axonales sur de nombreuses pistes axonale au sein d'un nerf segmentaire larvaires Notez les blobs de la GFP, ce qui représente des accumulations axonale.
Figure 2: Une image représentative montrant une seule piste axonale avec de nombreuses vésicules axonales au sein d'un nerf segmentaire larvaires.