Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est un dosage in vitro dans les progéniteurs hématopoïétiques, qui forment des colonies dans un milieu semi-solide. Une combinaison de la morphologie des colonies, la morphologie cellulaire et la cytométrie de flux sont utilisés pour évaluer la capacité des progéniteurs à proliférer et se différencier ainsi les différentes lignées hématopoïétiques.
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Article de méthode
Colonie de cellules de formage (CFC) Dosage pour les cellules hématopoïétiques humaines
Dans cet article
Résumé
Résumé
Humaines hématopoïétiques cellules souches / progénitrices sont généralement obtenus à partir de la moelle osseuse, sang du cordon ou du sang périphérique et sont utilisées pour étudier l'hématopoïèse et la leucémogenèse. Ils ont la capacité de se différencier en lignées lymphoïdes et myéloïdes. Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est utilisé pour étudier la prolifération et la différenciation des progéniteurs tendance hématopoïétique par leur capacité à former des colonies dans un milieu semi-solide. Le nombre et la morphologie des colonies formées par un nombre fixe de cellules d'entrée fournir des informations préliminaires sur la capacité des progéniteurs de différencier et de proliférer. Les cellules peuvent être récoltées à partir des colonies individuelles ou de la plaque entière pour mieux évaluer leur nombre et les états de différenciation par cytométrie en flux et l'évaluation morphologique de Giemsa lames colorées. Ce test est utile pour évaluer la différenciation myéloïde mais pas lymphoïdes. Le myéloïde terme dans ce contexte est utilisé dans son sens large pour englober lignées granulocytaire, monocytaire, érythroïdes et mégacaryocytaires.
Nous avons utilisé ce test pour évaluer les effets des oncogènes sur la différenciation des primaires humaines dérivées de cellules CD34 + du sang périphérique. Pour cette fin sont les cellules transduites avec le contrôle de construire soit rétroviraux ou une construction exprimant l'oncogène d'intérêt, dans ce cas-NUP98 HOXA9. Nous employons un vecteur rétroviral couramment utilisés, MSCV-IRES-GFP, qui exprime un ARNm bicistronique qui produit le gène d'intérêt et un marqueur de la GFP. Les cellules sont pré-activés par de plus en plus la présence de cytokines pendant deux jours avant transduction rétrovirale. Après deux jours, les cellules GFP + sont isolés par tri cellulaire par fluorescence (FACS) et mélangé avec un milieu semi-solide contenant méthylcellulose complétées par des cytokines et incubés jusqu'au colonies apparaissent à la surface, généralement 14 jours. Le nombre et la morphologie des colonies sont documentés. Les cellules sont ensuite retirés des plaques, lavés, comptés, et soumis à la cytométrie en flux et l'examen morphologique. La cytométrie en flux avec des anticorps spécifiques à la surface cellulaire des marqueurs exprimés au cours de l'hématopoïèse fournit des informations sur la lignée et le stade de maturation. Des études morphologiques des cellules individuelles au microscope après coloration de Wright-Giemsa fournir des informations supplémentaires à l'égard de la lignée et la maturation. Comparaison des cellules transduites avec le vecteur contrôle vide à ceux transduites avec un oncogène révèle les effets de l'oncogène sur la différenciation hématopoïétique.
Protocole
1. PREPARATION DES REACTIFS
- Préparer des solutions stériles stock de 1000x de FMS liées tyrosine kinase 3 (FLT-3) ligand, granulocytes / macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), stem cell factor (SCF), la thrombopoïétine (TPO), l'interleukine (IL) -3 , et l'IL-6 conformément aux instructions du fabricant. Préparer une solution stérile d'actions Retronectin (1mg/ml) aussi selon les instructions du fabricant. Divisez ces solutions de stock en petites fractions aliquotes et de garder à -20 ° C pour éviter répétés de gel-dégel.
- Préparer FBS 2% en IMDM.
- Préparer milieu IMDM complet avec des concentrations finales de 20% de FBS, 2 mM de....
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Discussion
Le dosage de CFC a été largement utilisée pour déterminer la prolifération et la différenciation des modèles de progéniteurs hématopoïétiques et d'étudier les effets des oncogènes (4, 5). Il a l'avantage sur les cultures de liquide d'être un test clonal, telles que les colonies constituent la descendance d'un ancêtre unique et peut être retiré individuellement pour une analyse ultérieure. La limitation du dosage de CFC est qu'elle n'est pas adéquate pour la détection de progéniteurs plus immature.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous remercions le juge Alvin Siteman Cancer Center à Washington University School of Medicine et Barnes-Jewish Hospital à St Louis, MO, pour l'utilisation de la base Trieuse vitesse élevée de cellules, qui a fourni l'équipement et des services de cytométrie en flux de tri. Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de subventions et de santé R01 HL082549 K02 HL084179 (NRY). Le Siteman Cancer Center est soutenu en partie par un soutien du NCI Cancer Center Grant P30 CA91842.....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| Sérum bovin foetal (FBS) | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Pénicilline/Streptomycine (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| Ligand FLT-3 | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| Albumine sérique bovine | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Rétronectine | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| Solution de bleu de trypan (0,4 %) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| Milieu enrichi en méthylcellulose humain | R&D Systems | HSC005 | |
| Coloration de Wright/Giemsa | Harleco | 64571 | |
| Solution tampon phosphate, pH 6,4 - formule Giordano | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| Méthanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| Sérum de souris normal | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| Anti-CD11b humain conjugué à la phyc–réthrine | BD Biosciences | 555388 | |
| Anti-CD33 humain conjugué à l'allophtocyanine | BD Biosciences | 551378 | |
| Anti-CD45 humain conjugué à la phyc–réthrine-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| Anti-CD71 humain conjugué à la phyc–réthrine | BD Biosciences | 555537 | |
| Anti-CD235a humain conjugué à l'allophtocyanine | BD Biosciences | 551336 | |
| Anti-CD45 humain conjugué à la phyc–réthrine-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| Plaques de culture tissulaire de 24 puits, non traitées | BD Biosciences | 35-1147 | |
| Boîte de 30 mm, non traitée | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| Boîte de culture tissulaire de 100 mm | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Boîtes de comptage quadrillées | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| Tubes coniques de 15 ml | BD Biosciences | 35-2097 | |
| Tubes coniques de 50 ml | BD Biosciences | 35-2070 | |
| Seringues de 3 ml | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| Aiguille émoussée de 16 gauge, 1½ pouce | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| Filtre cellulaire CellTrics de 50 μm | Partec | 04-004-2327 | |
| Hémocytomètre | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Chambres d'échantillonnage TPX | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Lames de microscope Fisherbrand Superfrost/Plus, prénettoyées | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cartes filtres Shandon | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Support de lame Shandon pour cytospin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Ensemble complet de coloration Shandon 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| Papier filtre de 1 μm | VWR international | 28307-134 | |
| Microscope inversé | Nikon Instruments | Diaphot | |
| Caméra de microscope | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
| Caméra de microscope | Olympus Corporation | DP71 | |
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | |
| Agitateur vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Incubateur de culture tissulaire | Sanyo | MCO-18AIC | |
| Cytospin | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| Centrifugeuse de table | Eppendorf | 5810-R | |
| Système de purification d'eau | Barnstead | Nanopure-Diamond |
Références
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R.
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Réimpressions et autorisations
