Un protocole pour l'isolement et l'activation de spermatides de mâle C. elegans Est décrit ici. Couper l'extrémité postérieure de spermatides communiqués de sexe masculin. Les spermatides peuvent être activés par l'ajout de protéase.
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Article de méthode
L'isolement et la In vitro Activation des Caenorhabditis elegans Sperme
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les mâles et les hermaphrodites sont les deux formes sexuelles naturellement trouvé dans le nématode C. elegans. Les spermatozoïdes sont produits par amiboïde deux mâles et hermaphrodites. Dans la phase antérieure de la gamétogenèse, les cellules germinales des hermaphrodites se différencier en un nombre limité de sperme - environ 300 - et sont stockés dans un petit «sac» appelé la spermathèque. Plus tard, les hermaphrodites produisent continuellement ovocytes 1. En revanche, les mâles produisent des spermatozoïdes exclusivement au long de leur vie adulte. Les mâles produisent des spermatozoïdes, si bien qu'il représente> 50% des cellules totales dans un deux ver adulte typique. Par conséquent, isoler les spermatozoïdes de mâles est plus facile que de celui des hermaphrodites.
Seule une faible proportion d'hommes sont naturellement généré spontanée due à la non-disjonction des chromosomes X 3. Traversée hermaphrodites avec des mâles ou plus commodément, l'introduction de mutations pour donner naissance à Lui (incidence élevée de mâles) phénotype sont certaines des stratégies à travers lequel on peut enrichir la population masculine 3.
Les mâles peuvent être facilement distingués des hermaphrodites en observant les quatre morphologie de la queue. La queue Hermaphrodite est souligné, tandis que la queue mâle est arrondi avec des structures d'accouplement.
Couper la queue des communiqués grand nombre de spermatides stockées à l'intérieur l'appareil reproducteur masculin. La dissection est réalisée sous un microscope stéréo en utilisant des aiguilles de calibre 27. Depuis spermatides ne sont pas physiquement connecté avec les autres cellules, la pression hydraulique expulse le contenu interne du corps masculin, y compris les spermatides 2.
Les mâles sont directement disséqués sur une petite goutte de 'moyen du sperme ». Spermatides sont sensibles à l'altération du pH. Ainsi, HEPES, un composé avec une bonne capacité tampon est utilisé dans les médias du sperme. Le glucose et d'autres sels présents dans les médias du sperme aider à maintenir la pression osmotique pour maintenir l'intégrité des spermatozoïdes.
Post-méiotiques différenciation des spermatides en spermatozoïdes est appelée spermiogenèse ou l'activation des spermatozoïdes. Shakes 5, 6 et Nelson précédemment montré que les spermatides rondes peuvent être induites à se différencier en spermatozoïdes en ajoutant des composés activant diverses, y compris Pronase E. Ici nous démontrons in vitro de la spermiogenèse de C. spermatides elegans utilisant Pronase E.
Spermiogenèse réussie est pré-requis pour la fertilité et donc les mutants défectueux dans spermiogenèse sont stériles. Jusqu'alors plusieurs mutants ont été révélé défectueux spécifiquement dans sept processus de spermiogenèse. Anomalie trouvée lors de l'activation in vitro du roman de SPE (spermatogenèse défectueuse) mutants serait nous aider à découvrir d'autres joueurs participant à cet événement.
Protocole
1) L'enrichissement de la population masculine
- Selon le besoin d'expérimentation, un grand nombre de mâles peut être obtenu en employant l'une des stratégies suivantes:
- grande population de mâles de type sauvage peut être obtenu par croisement 5 mâles de type sauvage et une hermaphrodite, sur une petite pelouse de l'OP50 ensemencé au centre de la plaque de NGM. Environ 50% de la génération suivante sera mâles de type sauvage.
- lui-5 (e1490) ou lui-8 (e1489) hermaphrodites jettent grand nombre de mâles. lui-5 et lui-huit mâles sont fertiles et il n'y a aucun défaut évident dans la morphologie des spermat....
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Discussion
En plus d'analyser des mutants Spe, ce protocole a d'autres applications importantes, comme l'analyse la morphologie des spermatozoïdes avec le vieillissement. Spermatides et des spermatozoïdes isolés en utilisant ce protocole peut être utilisé dans d'autres expériences en aval tels que, immunomarquage de type sauvage et le sperme mutant 8, 9, de la motilité du sperme sur des lames 10, des mesures physiologiques 9, 11, ou même l'insémination artificielle 12.
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous remercions Samuel Ward, Diane C. Shakes et Gregory Nelson pour le pionnier de cette technique. Nous tenons à remercier Pavan Kadandale et Brian Geldziler des vidéos montrant des spermatozoïdes activé; des membres du laboratoire pour les discussions utiles Singson; CCG pour les souches et les NIH pour nous soutenir par le biais de subvention (R01HD054681).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Seringue tuberculine | BD Biosciences | 309623 | Seringue : 1 ml, aiguille : 27G X ½ po |
| Stylo à paraffine | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| Plaques de microscope VWR VistaVision HistoBond | VWR international | 16004-406 | Dimensions : 75 × 25 × 1 mm |
| Lame à couvrir | VWR international | 48366045 | |
| Protéase | Sigma-Aldrich | P-6911 |
Références
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods ....
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Réimpressions et autorisations
