Surveillance des cellules immunitaires trafic fluorescent Rods Prion heures après l'infection par voie intrapéritonéale

Résumé

Nous décrivons ici un nouveau test pour la surveillance et le trafic de l'absorption du prion par les cellules immunitaires, immédiatement après l'inoculation intrapéritonéale en purifiant et en fluorescence étiquetage tiges prion agrégés à partir de tissu cérébral infecté, puis le suivi de leur absorption et le mouvement à partir du site d'injection et la caractérisation des cellules médiation de ces événements.

Résumé

Présence d'une forme anormale d'une protéine prion codée par l'hôte (PrPc) qui est résistant à la protéase, pathologiques et infectieux caractérise les maladies à prions comme la maladie débilitante chronique (MDC) des cervidés et la tremblante du mouton. L'hypothèse du prion, affirme que ce conformère anormal constitue plupart ou la totalité du prion infectieux. Le rôle du système immunitaire dans les événements précoces dans la pathogenèse du prion périphérique a été démontré de façon convaincante pour le MDC et la tremblante ^1-3. Des études pharmacologiques transgéniques et des souris ont révélé un rôle important du système du complément à conserver et reproduire les prions tôt après l'infection ^4-6. In vitro et in vivo ont également observé la rétention des prions par les cellules dendritiques ^7-10, bien que leur rôle dans le trafic reste clair ^11-16. Les macrophages ont eux aussi été impliqués dans la pathogenèse du prion début, mais ces études ont porté sur les événements survenus semaines après l'infection ^3,11,17. Ces études antérieures souffrent également du problème de la différenciation entre endogènes PrP ^C et les prions infectieux. Nous décrivons ici un semi-quantitative, approche impartiale pour évaluer l'absorption du prion et le trafic du site d'inoculation par les cellules immunitaires recrutées là. Tringles à prions ont été agrégées purifiée à partir de l'homogénat de cerveau infecté par solubilisation d'un détergent non agrégées de protéines et d'ultracentrifugation sur un coussin de saccharose. Électrophorèse sur gel polyacrylamide, le bleu de Coomassie coloration et l'ouest de la récupération buvard confirmés de tiges prion hautement enrichi dans la fraction culot. Tringles à prions ont été marqués par voie intrapéritonéale fluorochrome, puis injectées dans des souris. Deux heures plus tard les cellules immunitaires du liquide de lavage péritonéal, la rate et les ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques ont été analysés pour la rétention des prions tige et sous-ensembles de cellules identifiées par cytométrie en flux utilisant des marqueurs multicolores pour les monocytes, les neutrophiles, les cellules dendritiques, les macrophages et les cellules B et T. Ce test permet la surveillance directe de la première fois des cellules immunitaires acquisition et prions le trafic in vivo dans les heures suivant l'infection. Ce test a également différencie clairement infectieuses, les prions agrégés à partir de la PrPC normalement exprimé sur les cellules hôtes, ce qui peut être difficile et conduire à des problèmes d'interprétation des données dans les systèmes de dosage d'autres. Ce protocole peut être adapté à d'autres voies d'inoculation (voie orale, intraveineuse, intranervous et sous-cutanée, par exemple) et les antigènes (perles conjugués, les agents pathogènes bactériens, viraux et parasitaires et les protéines, les œufs) ainsi.

Protocole

1. Purifiant et l'étiquetage des tiges à prions

Ce protocole est adapté d'un ¹⁸ précédemment publiés

1. Homogénéiser 100 grammes de prion infectées par le tissu cérébral dans 900 ml de glace de tampon d'homogénéisation froid (HB, 1X PBS contenant 320 mM de saccharose, NaCl 150 mM EDTA et 4mm) 1 min à vitesse maximale dans une publicité mixeur, puis 2 min sur la glace. Répétez trois fois.
2. Centrifuger l'homogénat pendant 10 min à 3000 xg et 4 ° C. Retirer et conserver le surnageant sur la glace. Re-suspendre le culot dans 1L HB et répétez les étapes 1.1 et 1.2.
3. Surnageants Piscine et centrifuger pendant 60 min à 100 000 xg, à 0 ° C. Rejeter le surnageant.
4. Re-suspendre le culot dans 100 ml d'une solution saline tamponnée Tris 1X (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM de NaCl et 1 mM EDTA) contenant 2% de Triton X-100 (TBST). Estimer la concentration de protéines par les Bradford ou dosage similaire et ajuster à 5 mg / mL dans TBST. Réfrigérer la glace pendant 30 min.
5. Centrifuger pendant 30 min à 100 000 xg, à 0 ° C. Rejeter le surnageant et laver culot avec 50 ml TBST puis 100 ml SCT. Re-suspendre le culot dans 100 ml PBS 1X contenant sarcosyl 1% et le cocktail inhibiteur de la protéase et remuer pendant 120 min à 37 ° C.
6. Couche échantillon sur 900 ml de 320 mM de saccharose et centrifuger pendant 60 min à 100 000 xg, 10 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de NaCl 2,3 M, sarcosyl 5%.
7. Soniquer échantillon de 5 x 40 secondes à puissance maximale de 70% à intervalles de 1 min sur la glace.
8. Aliquote de 1 ml d'échantillon dans des tubes Eppendorf et centrifuger pendant quinze minutes à 13000 xg, 4 ° C. Lavez granules deux fois avec le SCT et stocker @ -70 ° C ou conjugué au fluorochrome à l'étape 1.9.
9. Conjugué 1 tube de cannes à prions purifiés en utilisant une fiole de 649 DyLight fluorochrome selon le protocole du fabricant.
10. Échange de tampon étiquetage DyLight pour PBS par dialyse ou par centrifugation à travers des colonnes de filtration. Boutique en 20 aliquotes à -70 ° C loin de la lumière jusqu'au moment de servir.

2. L'inoculation de prions et la récupération des cellules

Cette section englobe l'inoculation du prion par voie intrapéritonéale et la récupération des cellules du péritoine, les ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques et la rate.

1. Diluer tiges prion fluorescentes 1:50 dans du PBS immédiatement avant l'utilisation. La souris Scruff par la fourrure dorsale du cou avec le pouce et l'index, tourner doucement la souris face à vous et à freiner la queue avec petit doigt. Supination souris, élevant le torse arrière dessus de la tête et lui tenant légèrement à l'envers.
2. En utilisant une seringue d'insuline 30G, injecter 100 ml de tiges prion fluorescent 1 cm de la ligne médiane et 1-2 cm en avant de l'articulation sacro-iliaque. Insérez l'aiguille à 1 cm par la peau réalisé à 45 ° en dedans. Utilisez dilution 1:50 de perles fluorescentes ou PBS seul comme témoins. Incuber souris pour le temps imparti avant l'analyse.
3. Euthanasier les souris en fonction de soins des animaux et l'utilisation de protocoles approuvés comité. Injecter 10 ml de PBS dans la cavité péritonéale utilisant une seringue de 12 ml et une aiguille 25G. Secouez délicatement la carcasse longitudinalement pendant une minute. Récupérer suspension de cellules provenant du péritoine en utilisant la même seringue et une aiguille 16G dans un tube de 15 ml conique et réserve sur la glace tout en la dissection des carcasses se poursuit.
4. Mouiller la partie ventrale de la carcasse soigneusement avec de l'éthanol à 70%. Soulever la peau au niveau de la ligne médiane, juste sous la cage thoracique avec une pince et couper une petite incision dans la peau avec des ciseaux. À partir de là, faire une incision 3-5 cm de long à travers la peau dans les deux directions à partir de la tête et la queue, puis deux incisions de 2 cm de la ligne médiane latéralement de chaque côté. Peler et la broche de la peau pour révéler les cavités péritonéale et thoracique. Découpez soigneusement à travers les membranes minces translucides entourant le péritoine et reflètent le thorax pour révéler le médiastin.
5. Trouver et supprimer 2-4 ganglions lymphatiques médiastinaux, légèrement dorsale et latérale adjacente au thymus, médiane adjacente à l'artère brachiocéphalique, près de la face ventrale de la trachée. Trouver et supprimer jusqu'à six ganglions mésentériques, intégrés dans le tissu mésentérique blanc doux qui ancre les intestins pour la paroi abdominale postérieure. Trouver et supprimer la rate, un long, orgue rouge foncé situé juste latéral de la ligne médiane et dorsale de l'intestin sur le côté gauche de l'abdomen. Ganglions lymphatiques réserve dans 1 ml de milieu RPMI 1640 sur la glace jusqu'à ce que la dissection est terminée.
6. Laisser macérer et appuyez sur les ganglions lymphatiques à travers une passoire 40 um dans 3 mL de RPMI dans un plat en plastique de Petri en utilisant le piston d'une seringue de 1 ml. Rincer la crépine avec un supplément de 2 ml de RPMI et le transfert de la suspension 5 ml de cellules dans un tube de 15 ml conique. Rincez les boîtes de Pétri avec un supplément de 5 ml de RPMI et le transfert dans le même tube. Centrifuger 5 min à 250 xg, éliminer le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de tampon FACS (PBS 1X, 1% d'albumine sérique bovine et 10 mM d'EDTA) et transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.

ove_title "> 3. Cellule de coloration et de cytométrie en flux

Ce qui suit est un protocole de coloration typique pour l'identification des sous-ensembles de cellules immunitaires utilisant des anticorps fluorescents contre le bien-immunes caractérisées marqueurs de surface cellulaire. Tous les anticorps ont été dilués dans du tampon FACS immédiatement avant utilisation.

1. Comptez cellules et ⁶ cellules aliquote de 10 dans des tubes Eppendorf. Centrifuger les cellules (voir 2.7) et laver granules 2X avec 1 ml de tampon FACS.
2. Incuber les cellules 20 min sur la glace dans 100 ul de 2 ng / mL chez le rat anti-souris CD16/32 pour bloquer les récepteurs Fc endogène. Pellet et les cellules de lavage avec du tampon FACS.
3. Ajouter 100 ul de 1 ng / mL appropriée fluorescentes antibod (nt) à chaque échantillon et incuber sur de la glace pendant une heure. Ajouter 100 ul de tampon FACS seul pour les cellules de contrôle. Pellet et cellules laver deux fois avec du tampon FACS.
4. Re-suspendre les cellules dans une mémoire tampon ACK ml (150 mM de NH ₄ Cl, 1 mM _de KHCO3 et 0,1 mM d'EDTA) Incuber dans la glace pendant 1 min pour lyser les globules rouges. Pellet et les cellules de lavage avec du tampon FACS. Re-suspendre les cellules dans 1 ml de tampon FACS.
5. Recueillir des données à partir des cellules en utilisant un cytomètre en flux capable de détecter multicolore et d'analyse, généralement avec des lasers 405, 488 et 633 nm d'excitation et de cinq à dix détecteurs d'émission de fluorescence.

4. Les résultats représentatifs:

Nous avons purifié à partir des tiges prion brut, solubilisation Détergent prion homogénat de cerveau infecté (figure 1) et d'ultracentrifugation de l'homogénat E2 élans du cerveau (voies 1 et 2) considérablement enrichi pour les tiges de prion (comparer les pistes 1 et 3), qui était également la protéase K résistants (piste 4). Fait intéressant, non digérées tiges prions purifiés affiché un profil glycoforme étonnamment semblables à E2 homogénat cérébral digéré, indiquant un enrichissement spectaculaire des prions. Identiquement traités homogénat de cerveau normal produit aucun PK-résistante PrP ^C (pistes 5 et 6).

L'analyse par cytométrie en flux des populations de cellules spécifiques de démontrer que les cellules présentatrices d'antigènes chez le péritoine de deux heures et de retenir des billes fluorescentes et les tiges à prion, comme en témoigne par fluorescence considérablement augmenté au cours des contrôles PBS injecté (figure 2). Pas de cellules récoltées dans le péritoine de PBS témoins traités affiché fluorescence au-dessus de fond (fig. 2A-G), tandis que les cellules du cordon (fig. 2H-N) et du prion (fig. 2O-U)-souris inoculées affiché par fluorescence significative, en particulier sur les monocytes (fig. 2I et P), les cellules dendritiques (fig. 2K et R) et les macrophages (fig. 2L et S), et quelques neutrophiles (figure 2J et Q) et les cellules B moins (2T figure). Perle et prions portant monocytes, cellules dendritiques et les macrophages ont également été trouvés dans les ganglions lymphatiques médiastinaux deux heures après l'inoculation (fig. 2AD et AK, AF et AM et AG et AN, respectivement), tandis que peu ou pas de PrP ^CWD portant neutrophiles , les cellules B ou T ont été trouvés là (fig. 2AE et AL, AH et AG et AI et AP, respectivement). Nous n'avons détecté aucune perles ou des baguettes de prion dans la rate ou des ganglions mésentériques (données non présentées). Dans sa totalité, ces données démontrent que la circulation des cellules immunitaires prions très similaire à des antigènes autres particules.

REACTIFS	Fluorochrome	Excitation laser (nm)	Pic d'émission (nm)
Tringles à prions	DyLight 649	633	674
Billes 1 um	AlexaFluor 660	633	685
Anticorps
CD11b	eFluor 450	405	450
	Phycoérythrine-Cy7	488	760
CD11c	R-phycoérythrine	488	575
	Phycoérythrine-Cy7	488	760
Ly6C	Fluoroisothiocyante	488	518
Ly6G	R-phycoérythrine	488	575
CD21	DyLight 488	488	518
B220	Allophycocyanine-Cy7	633	785
CD3	R-phycoérythrine	488	575

»> Tableau 1. Propriétés spectrales des réactifs fluorescents

Figure 1. Purification des tiges prions d'homogénat de cerveau infecté. Nous avons utilisé un homogénat brut de 10% du cerveau d'un cerf MDC-infectés (E2, les voies 1 et 2) comme matériau de départ à partir de laquelle nous avons purifié tiges prion agrégées (voies 3 et 4). Les deux matériaux bruts et purifiés ont montré une résistance caractéristique à la protéase K traitement (voies 1 - 4), tandis que homogénat de cerveau normal ne (pistes 5 et 6). Des marqueurs de poids moléculaire sont présentés dans Kd à la gauche de la tache. BH, homogénat de cerveau.

Figure 2. L'analyse par cytométrie en flux de cellules immunitaires prions le trafic du péritoine vers les ganglions lymphatiques médiastinaux deux heures après l'inoculation. PBS (panneaux AG et V-AB), des perles fluorescentes (HN et AC-AI) ou de barres à prions (UO et AJ-AP) ont été injectée dans le péritoine des souris et des cellules récoltées à partir du liquide de lavage péritonéal (UA) ou les ganglions lymphatiques médiastinaux (V-AP), deux heures plus tard. Les graphiques dans les premières cellules montrent colonne à partir de souris traitées avec du PBS (panneaux A et V), des perles fluorescentes (panneau H et AC) et les tiges du prion (panneaux O et AJ). Cellules fluorescentes (points rouges ou vertes) et des cellules totales (points gris) sont tracées pour montrer la taille relative (diffusion vers l'avant), la granularité (diffusion latérale) et la proportion du total des cellules vivantes qui sont fluorescents. Un nombre important de cellules caractéristiques des granulocytes conservé perles fluorescentes et les tiges. Les cellules ont également été colorées avec des anticorps contre le système immunitaire des marqueurs de surface cellulaire et fermé pour LYG-Ly6C + monocytes (panneaux B, I, P, W, AD et AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + neutrophiles (C, J, Q, X, AE et AL), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + cellules dendritiques (D, K, R, Y, AF et AM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + macrophages, (E, L, S, Z, AG et AN), CD3 -B220 + CD21 + cellules B (F, M, T, AA, AH et AO) et CD21-B220-cellules T CD3 + (G, N, U, AB, AI et AP). Les monocytes, les cellules dendritiques et les macrophages conservé perles fluorescentes et les tiges du prion dans la cavité péritonéale (panneaux I et P, K et R et L et S, respectivement) et les a transportés vers les ganglions lymphatiques médiastinaux (panneaux AD et AK, AF et AM et AG et AN, respectivement), démontrant ainsi l'absorption similaires et la traite de ces deux particules. Les neutrophiles conservé une importante quantité de perles (J) et moins de tiges (Q), mais a omis de les livrer aux ganglions lymphatiques (AE et AL). Les cellules B conservé et transporté quelque tiges (T et AO), mais pratiquement pas de perles (M et H). Les cellules T, ni victimes, ni perles baguettes (N, U, AI et AP).

Discussion

Ici nous démontrons un protocole de marquage et de suivi des prions in vivo qui facilite grandement le suivi des événements précoces de l'infection à prion périphériques. Ce protocole améliore grandement sur ​​les tentatives passées au absorption prion surveillance in vitro et in vivo ^{9 3,12} en pré-étiquetage inoculum prion hautement enrichi sans ambiguïté le différencier de la PrP ^C endogène. Parce que les prions infectieux et la PrP ^C partagent la même sé...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cerveau de wapiti infecté par la maladie de la dégénérescence chronique	Élevage privé de wapitis au Colorado		Utiliser tout cerveau infecté par un prion non humain
Blender	Oster Professional Products	6694-015	Utiliser n'importe quel blender commercial
Centrifugeuse	Sorvall, Thermo Scientific	rotor SS34	Utiliser n'importe quelle centrifugeuse / rotor capable d'atteindre 3000 x g et de contenir des volumes ≥ 500 ml
Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter Inc.	rotor 50.2 Ti	Utiliser n'importe quelle ultracentrifugeuse / rotor capable d'atteindre 100 000 x g et de contenir des volumes ≥ 500 ml
Réactif de Bradford	Sigma-Aldrich	B6916
Cocktail d'inhibiteurs de protéase complet mini	Roche Group	11 836 170 001
Sonicateur	Misonix	MP4000X	Utiliser n'importe quel sonicateur à sonotrode ou à sonde réglé à environ 70 % de la puissance maximale
Kit de marquage d'anticorps DyLight	Thermo Fisher Scientific, Inc.	53050
Microcentrifugeuse	Eppendorf	55430R	Utiliser n'importe quelle microcentrifugeuse réfrigérée capable d'atteindre 13 000x g
Colonnes filtrantes centrifuges	EMD Millipore	Microcon YM-100	Utiliser n'importe quel filtre ou membrane de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 100 kDa
Souris FVB âgées de 8 à 40 semaines	Charles River Laboratories	207	Utiliser n'importe quelle souche consanguine de souris
Billes fluorescentes rouges de 1 μm	Phosphorex	2307	Utiliser n'importe quelle bille fluorescente ≤ 10 μm
Milieu RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Filtre cellulaire de 40 μm	Falcon BD	352340
Anticorps fluorescents	BD Biosciences	Divers	Utiliser n'importe quel anticorps fluorescent approprié pour votre application.
Cytomètre en flux	Dako	CyanADP	Utiliser n'importe quel cytomètre en flux capable de détection multicolore par fluorescence