Protocole pour la production d'un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

Résumé

Croisements génétiques des parasites du paludisme chez les rongeurs sont effectuées en alimentant deux des parasites génétiquement distinctes pour les moustiques. Recombinant progéniture clonée à partir de sang de souris après avoir laissé les moustiques de mordre des souris infectées. Cette vidéo montre comment produire des croisements génétiques Plasmodium yoelii Et est applicable à d'autres parasites du paludisme chez les rongeurs.

Résumé

Variation de la réponse aux médicaments antipaludiques et dans la pathogénicité des parasites du paludisme est de l'importance biologique et médicale. Cartographie de liaison a conduit à l'identification réussie de gènes ou loci sous différents traits de parasites du paludisme des rongeurs ^1-3 et humains ^4-6. Le parasite du paludisme Plasmodium yoelii est l'une des nombreuses espèces de paludisme isolé de rongeurs africains sauvages et a été adapté à croître dans les laboratoires. Cette espèce se reproduit de nombreuses caractéristiques biologiques des parasites du paludisme humain; marqueurs génétiques tels que des microsatellites et amplifié fragment length polymorphism (AFLP) ont également été développés pour le parasite ^7-9. Ainsi, les études génétiques des parasites du paludisme des rongeurs peuvent être effectués pour compléter les recherches sur Plasmodium falciparum. Ici, nous montrons les techniques de production d'un croisement génétique de P. yoelii qui ont d'abord mis au point par les Drs. David Walliker, Richard Carter, et ses collègues de l'Université d'Edimbourg ^10.

Croisements génétiques de P. yoelii et autres parasites du paludisme chez les rongeurs sont menées en infectant les souris Mus musculus avec un inoculum contenant des gamétocytes de deux clones génétiquement distincts qui diffèrent dans les phénotypes d'intérêt et en permettant aux moustiques de se nourrir de souris infectées quatre jours après l'infection. La présence de gamétocytes mâles et femelles dans le sang au microscope de la souris est confirmée avant la tétée. Dans les 48 heures après le repas, dans l'intestin moyen du moustique, les gamétocytes haploïdes se différencier en gamètes mâles et femelles, fertiliser, et forment un zygote diploïde (Fig. 1). Pendant le développement d'un zygote dans un ookinète, méiose semble se produire ^11. Si le zygote est dérivée par la fertilisation croisée entre les gamètes des deux parasites génétiquement distinctes, les échanges génétiques (réassortiment chromosomiques et cross-overs entre les chromatides non-sœurs d'une paire de chromosomes homologues;. Fig 2) peut se produire, résultant en une recombinaison du matériel génétique au locus homologue. Chaque zygote subit deux divisions successives nucléaires, conduisant à quatre noyaux haploïdes. Un ookinète développe davantage dans un oocyste. Une fois l'oocyste mûrit, des milliers de sporozoïtes (la descendance de la croix) sont formés et libérés dans hemoceal moustiques. Les sporozoïtes sont récoltées à partir des glandes salivaires et injecté dans un nouvel hôte murin, où le développement stade pré-érythrocytaire et érythrocytaire a lieu. Formes érythrocytaires sont clonés et classés à l'égard des caractères distinctifs des lignées parentales avant la cartographie de liaison génétique. Contrôle des infections de l'individu clones parentaux sont effectuées de la même manière que la production d'un croisement génétique.

Protocole

Techniques d'asepsie doivent être appliquées à tous les matériaux qui seront administrés dans des animaux pour éviter l'introduction involontaire d'agents infectieux exogènes dans des souris qui peuvent confondre les résultats expérimentaux.

1. L'infection de souris de laboratoire avec des parasites du paludisme au stade sanguin

1. A température ambiante, le dégel deux flacons contenant les parasites du sang congelé stade de la malaria à franchir. Dans cet exemple, deux souches de rongeur parasite du paludisme Plasmodium yoelii sont utilisés yoelii et Plasmodium yoelii nigeriensis.
2. Fit une seri....

Discussion

Nous démontrer les techniques pour la production d'un croisement génétique chez le rongeur le paludisme à Plasmodium yoelii, qui est également applicable à la production des croisements génétiques dans les paludismes autres rongeurs. Infections des souris avec une seule clones parentaux sont généralement effectués pour déterminer la transmission réussie des parasites des parents pour s'assurer que les parents sont compétents dans la production de gamètes fonctionnels avant d'effectuer une croix.

Matériaux

MATÉRIAUX SUPPLÉMENTAIRES:

• Entretien des souris de laboratoire
• Entretien du laboratoire des moustiques
• L'examen microscopique des frottis sanguins minces colorés avec le colorant de Giemsa
• Mesure de la densité des globules rouges

Entretien des souris de laboratoire

Les femelles de souche de laboratoire de souris consanguines BALB / c, âgés de 5 à 8 semaines, sont utilisées dans l'étude. Les souris sont logées dans un standard solide fond de la cage en polycarbonate avec fil-bar couvercle, équipé d'engraissement et une bouteille d'eau. Les souris sont maintenus à une température constante (25 ± 1 ° C) sur 12:12 heures de lumière: le cycle noir. Les souris sont autorisés à se nourrir de 2018S Harlan Teklad mondiale régime protéiné rongeurs 19% extrudé (stérilisable; de ​​Harlan-Teklad) et fourni avec acidifiés potable de l'eau ad libitum. Expériences sur les animaux sont effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation à l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses en vertu du protocole LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Entretien du laboratoire des moustiques

Les moustiques sont d'une colonie de laboratoire de race Anopheles stephensi. Les adultes sont maintenus dans des cages en nylon maintenu à une température et humidité contrôlées ambiante (23 à 25 ° C pour le Plasmodium yoelii et Plasmodium chabaudi, et 19 à 21 ° C pour Plasmodium berghei, 80 à 95% humidité; le 12:12 heures de lumière: le cycle sombre). Les moustiques adultes sont nourris avec du glucose à 10% et 2,00% acide para-aminobenzoïque (PABA) une solution d'eau complété. Pour obtenir de haute qualité aux adultes, 500 larves sont cultivées dans un état ​​de faible densité dans 1 L d'eau distillée dans un 1000 cm ^3-plat ouvert fourni avec environ 1 mg de bicarbonate de sodium. Après éclosion, les larves sont donnés TetraMin poudre (PETCO) jusqu'à ce qu'ils développent dans le stade de pupe et sont transférés vers les cages de moustiques adultes pour les pays émergents.

L'examen microscopique des frottis sanguins minces colorés avec le colorant de Giemsa

Avec des ciseaux propres coupez l'extrémité (1,0 mm) de la queue de la souris infectée. Déposer une goutte (0,5-1,0 uL) de sang de la queue sur une lame de spécimen propre. La souris arrêter le saignement dans les 1-2 min. Placez une diapositive épandeur de nettoyage sur le dessus de la goutte de sang, son maintien à un angle de 45 ° par rapport à la diapositive échantillon, et permettre au sang d'adsorption sur toute la largeur de l'épandeur. Tenir la lamelle de préparation et de faire avancer la diapositive écarteur rapidement et en douceur pour produire un frottis mince. Laissez le film de sang sec, puis plonger les lames dans du méthanol absolu. Laisser la lame sécher à l'air une fois de plus avant de le couvrir au Giemsa (10% de colorant Giemsa à l'eau distillée). Après incubation des films minces de sang pendant 10-15 min à température ambiante, rincer soigneusement les lames avec de l'eau du robinet et laissez sécher à l'air. Examinez le nombre de globules rouges infectés (CISR; voir la figure 3 pour la morphologie des personnes infectées RBC) sous un microscope à lumière avec de l'huile d'immersion à un grossissement de 1000x (avec lentille de l'objectif 100x) et calculer la parasitémie (le nombre d'CISR par 100 RBC comptés). Différentes souches de parasites du paludisme varie en taux de croissance et la pathogénicité. Suivi des parasitémies stade sanguin peut être effectué 24 heures après les injections, en fonction de la dose de parasites du sang, le paludisme scène. Par exemple, les souris seront positifs au microscope 24 heures lorsqu'il est injecté avec 10 ⁷ infectées par voie intrapéritonéale RBC ou 10 ⁶ infectées RBC par voie intraveineuse.

Mesure de la densité des globules rouges

Comme les niveaux de parasitémie, de globules rouges (RBC) de densité chez les souris infectées varie tout au long du cours de l'infection. La densité de RBC doit être mesurée dans les 1-2 heures avant le début de l'infection unique et mixte clone et les expériences de clonage. Il existe deux méthodes pour la mesure de la densité de RBC: un comptage manuel en utilisant Neubauer hémocytomètre et une de comptage automatique en utilisant un Cellometer (Nexcelom Bioscience). Dans les deux méthodes, retirer 1 pl de sang de la queue de la souris en utilisant un capillaire en verre (VWR) et diluer dans 10 ml de PBS et mélangez bien. Pour utiliser un hémocytomètre Neubauer, charge de 20 pi de la suspension sur le hématimètre. Placez le hématimètre sur un microscope optique avec objectif 10x. L'hématimètre contient une grille divisée en 9 grandes places, et 4 grands carrés à l'angle sont encore divisés en 16 petits carrés. Compter le nombre total de cellules dans chacune des 16 petits carrés dans les quatre cases de coin. Pour éviter de compter partialité ou le comptage des cellules qui se chevauchent une ligne de grille, comptez une cellule comme "in" s'il recouvre les lignes haut ou à droite et "out" s'il recouvre les lignes en bas ou de gauche. Estimer le nombre de cellules par une petite place et diviser par 0,00625 (le volume d'un petit carré est de 6,25 nL). Cela donne le nombre de cellules par microlitre (&mu, L). De ces données, calculer la densité de la finale de globules rouges en multipliant avec 10.000 (un facteur de dilution). Rincer la lamelle et chambre de comptage de l'eau distillée et 70% d'éthanol; l'air sec. Sinon, charge de 20 pi de la suspension sur une lame de chambre Cellometer comptage. Insérez la lame dans une chambre de glisser Cellometer (le lecteur). Démarrez le logiciel Cellometer, sélectionnez l'option "globules rouges du sang" option, puis entrez un facteur de dilution de 10 000. Enregistrement de la densité de RBC.