Implantation d’une canule dans la citerne magna dans un modèle murin

Résumé

Source : Xavier, A. L. R., et al. Implantation de canule dans la citerne des rongeurs. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre la procédure d’implantation d’une canule dans la citerne géante d’une souris anesthésiée. La technique consiste à guider une canule montée sur l’aiguille à travers la dure-mère dans la citerne triangulaire inversée magna et à la fixer pour une administration ciblée dans le liquide céphalo-rachidien.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Intervention chirurgicale
   REMARQUE : La canulation chronique de la citerne magna (CM) permet aux animaux de se remettre de l’intervention chirurgicale. Les injections de CM sont effectuées le lendemain de l’implantation de la canule et, surtout, peuvent être effectuées chez des animaux anesthésiés ou éveillés. Comme il s’agit d’une chirurgie de récupération, les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles.
   1. Pesez la souris (C57BL/6JRj, des deux sexes, 8 semaines) et anesthésiez-la avec un mélange de kétamine et de xylazine (100 mg/kg ; 10 mg/kg, respectivement) par injection intrapéritonéale (i.p.). Si nécessaire, redosez à la souris une demi-dose de kétamine (50 mg/kg) pendant l’intervention chirurgicale. Alternativement, pour une canulation chronique, anesthésiez la souris en la plaçant dans une chambre d’induction d’isoflurane à 2,5 - 3 % d’isoflurane, à environ 1 L/min d’oxygène (O₂). Dans ce cas, utilisez un cône nasal pour maintenir l’anesthésie à l’isoflurane à 1,5 à 2 % tout au long de la chirurgie.
   2. Lorsque les réflexes de pincement des orteils cessent et que la respiration devient lente et régulière, placez l’animal dans un cadre stéréotaxique au-dessus d’un coussin chauffant.
   3. Appliquez une pommade ophtalmique. Répétez l’opération si nécessaire.
   4. Rasez la tête et le cou de la souris, enlevez la fourrure et stérilisez la peau exposée d’abord avec un tampon imbibé d’alcool, puis deux fois avec de la chlorhexidine (0,5 %) ou une solution d’iode (2 %). Répétez la stérilisation deux fois de plus.
      REMARQUE : Changez le champ chirurgical pour enlever les débris et les poils après le rasage. Ensuite, drapez l’animal pour protéger le champ stérile.
   5. En cas de canulation chronique, administrer 0,5 à 1 ml de lidocaïne/bupivacaïne (1 mg/ml et 0,25 mg/ml, respectivement) par voie sous-cutanée (s.c.) au site de l’incision. Administrer de la buprénorphine (0,05 mg/kg ; s.c.) pour l’analgésie post-chirurgicale.
   6. Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique. Après s’être assuré de la fixation, soit intra-auriculaire, soit par l’arc zygomatique, inclinez légèrement la tête de manière à ce qu’elle forme un angle de 120° par rapport au corps (Figure 1E).
   7. Trouvez la partie du crâne qui dépasse immédiatement au-dessus des muscles du cou - la crête occipitale. Soulevez la peau sus-jacente à l’aide d’une pince à épiler et coupez un morceau de peau en forme d’amande d’environ 1 cm le long de la ligne médiane. Utilisez des cotons-tiges ou des lances oculaires pour contrôler tout saignement qui en résulte.
   8. En utilisant la crête occipitale comme point de référence, séparez le tissu conjonctif superficiel pour exposer les muscles du cou en dessous.
   9. Séparez les muscles de la ligne médiane en passant soigneusement la pince au milieu du site d’incision dans l’axe antéro-postérieur. À l’aide d’une paire de pinces incurvées dans chaque main, joignez les pointes au milieu près du bas du crâne et écartez les muscles.
      REMARQUE : Cela devrait exposer le CM, qui apparaît comme un minuscule triangle inversé, délimité par le cervelet au-dessus et la moelle en dessous, derrière la membrane durale translucide (Figure 1B et 1C).
   10. À l’aide d’une lance oculaire chirurgicale ou d’un coton-tige, essuyez la membrane durale recouvrant le CM.
2. Insertion de la canule dans le CM
   1. Retirez la canule de la seringue remplie de liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF), en maintenant l’aiguille 30G attachée à l’extrémité arrière de la tubulure.
   2. Fixez l’aiguille 30G à une seringue de 100 μL remplie d’eau distillée reliée à une pompe à seringue.
   3. Insérez une bulle d’air d’environ 1 cm dans la canule en prélevant l’air à l’aide d’un pousse-seringue.
   4. À l’aide d’un pousse-seringue, prélever 12 μL du traceur de liquide céphalorachidien (LCR) souhaité dans la canule.
   5. Saisissez la canule, remplie du traceur du LCR, près de l’aiguille recouverte d’un tube à l’aide d’une pince à épiler incurvée tenue dans la main dominante. Posez le majeur de la main non dominante sur la barre d’oreille du côté opposé et maintenez-le stable pour une utilisation ultérieure comme repose-canule.
   6. Insérez la canule à un angle de 45° par rapport à la tête de la souris, en passant au centre du CM, identifié par son aspect triangulaire vu à travers la dure-mère. Évitez toute pénétration du cervelet ou de la moelle. Assurez-vous que l’aiguille n’est insérée qu’à une profondeur de 1 à 2 mm, par exemple jusqu’au point où le biseau est entièrement sous la dure-mère. Relâchez la pince à épiler qui maintient la canule et laissez la canule reposer sur la main non dominante.
      REMARQUE : L’extrémité biseautée des aiguilles dentaires nécessitera l’application d’une certaine force pour percer la membrane durale recouvrant le CM.
   7. Si nécessaire, séchez toute fuite de LCR lors de la pénétration à l’aide d’une lance oculaire chirurgicale ou de cotons-tiges.
   8. Appliquez 2 à 3 gouttes de colle cyanoacrylate sur la membrane durale entourant la canule. Ajoutez une goutte d’accélérateur de colle pour durcir la colle immédiatement. Couvrez le crâne et l’aiguille avec un mélange de ciment dentaire (environ 0,5 mg) et de colle cyanoacrylate (3 à 5 gouttes). Immédiatement après, appliquez une goutte d’accélérateur de colle pour durcir.

Résultats

Figure 1 : Injection de traceurs dans la citerne magna.) Vue d’ensemble schématique de la tête et du cerveau de la souris montrant l’emplacement de la citerne magna (CM) par rapport au cerveau et aux structures crâniennes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SOPIRA carpule 30G 0.3 x 12 mm	Kulzer	AA001
Chlorhexidine 0.5 % (digluconate de chlorhexidine)	Meda AS		http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/
Tampon imbibé d’alcool isopropylique à 70 % 30 x 60 mm	Vitrex Medical A/S	520213
Viskoese Oejendraeber Ophtha	Ophtha	145250
Applicateur en bois, coton-tige double (Ø environ, 4 - 5 mm, longueur environ, 12 mm)	Heinz Herenz	1032018
Lances oculaires	Medicom	A18005
Kimtech Science lingettes de précision essuie-mouchoirs	Kimberly Clark Professional	5511
Loctite super glue precision 5 g	Loctite		http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html
Insta-Set CA accelerator	Bob Smith Industries	BSI-152
Poudre de ciment dentaire	A-M Systems	525000
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 0,01 M ; pH 7,4)	Sigma Aldrich	P3813
Ovalbumine, conjugué Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	O34784
DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) solution (1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	62248
Dextran, fluorescéine, 3000 MW, anionique	Thermo Fisher Scientific	D3305
Ketaminol Vet 100 mg/mL (kétamine)	Intervet International BV	511519
Rompin Vet 20 mg/mL (xylazine)	KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH	148999
Xylocain 20 mg/mL (lidocaïne)	AstraZeneca	158543
Marcain 2,5 mg/mL (bupivacaïne)	AstraZeneca	123918
Bupaq Vet 0,3 mg/mL (buprénorphine)	Richter Pharma AG	185159