Injection de cellules progénitrices neurales fluorescentes dans des organoïdes cérébraux humains pour la modélisation de la transplantation

Résumé

Source : Ibanez-Rios, M.I., et al., A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (2023)

Cette vidéo montre l’injection de cellules progénitrices neurales (NPC) marquées par fluorescence dans des organoïdes cérébraux humains à l’aide d’un mélange de cellules et de matrices. La méthode est reproductible et sans animaux, ce qui permet une transplantation avec une perturbation minimale des organoïdes. Il offre une plate-forme précieuse pour la modélisation des greffes neuronales et des maladies du système nerveux central (SNC).

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d’échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l’IRB de l’institut.

1. Injection de cellules étiquetées dans l’organoïde cérébral

REMARQUE : Pour cet article, des organoïdes cérébraux ont été produits à l’aide d’un kit commercial selon les instructions du fabricant. Il peut être remplacé par l’organoïde cérébral d’intérêt. Les matériaux utilisés dans cette partie du protocole doivent être pré-refroidis pour éviter la gélification de la matrice de la membrane basale solubilisée à des températures supérieures à 4 °C.

1. Placez la ou les seringues à insuline, les embouts et les tubes qui vont être en contact avec la matrice de la membrane basale solubilisée à −20 °C pour les laisser refroidir.
2. Décongeler une aliquote de taille appropriée de matrice de membrane basale solubilisée sur de la glace, en fonction du nombre d’injections qui vont être effectuées (~2 μL/injection). Cela prend environ 30 minutes.
3. Pendant que l’aliquote décongèle, divisez, récoltez et comptez les cellules.
4. Calculez les volumes nécessaires par injection. Si vous faites plusieurs injections, placez le volume total des cellules dans un tube de 1,5 mL et ajoutez jusqu’à 1 mL de DMEM/F12.
   REMARQUE : Un volume qui permet quelques injections supplémentaires doit être utilisé pour tenir compte des pertes/erreurs de pipetage.
5. Placez les cellules dans de la glace pendant que les prochaines étapes sont préparées.
6. Après décongélation, diluer la matrice de la membrane basale solubilisée jusqu’à une concentration finale de 3 mg/mL dans du DMEM/F12 glacé.
7. Prélever la suspension unicellulaire de la glace et la faire tourner à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
   REMARQUE : S’il n’existe pas de centrifugeuse réfrigérée, l’essorage à température ambiante semble généralement toléré.
8. Retirez délicatement le milieu complètement sans déranger la pastille cellulaire. Remettez en suspension la pastille cellulaire par pipetage doux dans la matrice de membrane basale solubilisée diluée (3 mg/mL) pour obtenir un volume final de 2 μL par injection à effectuer, et remettez-la immédiatement sur la glace jusqu’à utilisation.
   REMARQUE : La remise en suspension des cellules doit être effectuée lentement et avec des pointes pré-réfrigérées pour éviter la formation de bulles et la gélification.
9. Transférez la ou les seringues pré-réfrigérées du congélateur à -20 °C dans un seau à glace. Gardez-les là jusqu’à utilisation.
10. Retirez la plaque avec les organoïdes cérébraux de l’incubateur. À l’aide d’une pointe à alésage large, transférez l’organoïde à injecter dans une boîte de 35 mm. Prélever tout le milieu possible sans endommager l’organoïde pour le stabiliser et faciliter l’injection.
    REMARQUE : Il est important d’utiliser des pointes à large calibre pour éviter de détruire l’organoïde. S’ils ne sont pas disponibles, coupez l’extrémité d’une pointe P1 000 régulière avec des ciseaux stériles.
11. Placez la boîte de 35 mm contenant l’organoïde sous un microscope de dissection pour aider à guider et faciliter l’injection.
    REMARQUE : Si un microscope de dissection n’est pas disponible dans une zone stérile, il est possible d’effectuer l’injection sans un, bien qu’avec un contrôle quelque peu réduit. Une autre alternative est l’utilisation d’une boucle de grossissement ou de lunettes.
12. Une fois que le ou les organoïdes sont prêts à être injectés, remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pointe de pipette P20 réfrigérée et déplacez 2 μL (contenant le nombre souhaité de cellules à injecter) sur une lame de verre stérile pré-refroidie.
    REMARQUE : Pour plusieurs injections, un volume supplémentaire de 2 μL peut être ajouté sur la lame de verre. Gardez-le sur de la glace et veillez à éviter l’évaporation.
13. Prenez une seringue à insuline pré-réfrigérée de la glace et aspirez lentement les 2 μL de suspension cellulaire avec le biseau de l’aiguille vers le bas pour permettre à toutes les cellules/milieux d’être absorbés.
    REMARQUE : Assurez-vous d’aller extrêmement lentement pour éviter d’aspirer de l’air.
14. Ouvrez le couvercle de la boîte contenant l’organoïde et concentrez le microscope sur celui-ci. Tenez le plat d’une main. Placez le biseau de l’aiguille vers le haut, et avec l’autre main, injectez lentement les cellules dans la surface de l’organoïde.
    REMARQUE : Il est important d’injecter lentement pour éviter d’endommager les tissus.
15. Après l’injection, remettez le couvercle dans la boîte et laissez l’organoïde injecté reposer pendant 1 à 2 min.
    REMARQUE : Cela permet à la matrice de la membrane basale diluée et solubilisée de se gélifier, maintenant les cellules en place. Si le milieu est ajouté trop tôt, il peut emporter les cellules situées à la surface.
16. Ajoutez doucement 500 μL de milieu organoïde et transférez l’organoïde avec une pointe à large calibre dans un puits d’une plaque à 24 puits. Incuber l’organoïde à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit. Effectuez des changements complets de milieu tous les deux jours.
    REMARQUE : Il est important d’inclure un organoïde de contrôle négatif (injecté de simulation), qui sera utilisé pour les ajustements d’imagerie. Pour ce faire, injectez un organoïde tel que décrit précédemment avec une matrice de membrane basale solubilisée diluée (3 mg/mL) pour obtenir un volume final de 2 μL sans cellules.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM F12/Glutamax	Thermo	10565018
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)	Corning	356231	sans rouge de phénol, sans LDEV