Quantification des amyloïdes induites par une infection bactérienne à l’aide de la fluorescence T de thioflavine

Résumé

Source : Balczon, R., et al. Méthodes de détection des amyloïdes cytotoxiques à la suite de l’infection de cellules endothéliales pulmonaires par Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre le protocole permettant de quantifier les amyloïdes dans les surnageants de culture à partir de cellules endothéliales pulmonaires infectées par des bactéries virulentes, à l’aide de la thioflavine T, un colorant fluorescent qui se lie aux structures de la bêta-feuillet amyloïde. Une augmentation de la fluorescence par rapport à la ligne de base indique la présence d’amyloïdes dans le surnageant de culture.

Protocole

1. Analyse des surnageants cytotoxiques

1. Pour effectuer un dosage de la thioflavine T (ThT), utilisez la fluorescence ThT pour quantifier les amyloïdes dans les surnageants. Pour ces mesures, utilisez des surnageants stérilisés par filtre.
   1. Préparez une solution mère (50x) de ThT en suspendant 8 mg de ThT dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Après le mélange, filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer les particules.
   2. Pour les mesures, ajouter 20 μL de stock ThT à 1 mL de PBS dans une cuvette de spectrophotomètre de 1 mL. Placez l’échantillon dilué dans un spectrofluorimètre.
   3. Mesurez l’émission de fluorescence de base à l’aide d’une excitation de 425 nm et balayez l’émission de fluorescence de 450 à 575 nm par incréments de 2 nm.
   4. Effectuez un balayage time-lapse en utilisant une excitation de 425 nm et une émission de 482 nm, avec des données acquises toutes les 0,2 s pendant 60 s.
   5. Les 20 premières secondes du balayage time-lapse mesurent la fluorescence dans la cuvette vierge. À 20 s, interrompre le balayage et ajouter 10 μL du surnageant stérilisé par filtre dans la cuvette. Mélangez la cuvette par inversion puis remettez-la dans le spectrofluorimètre.
   6. Reprenez le balayage temporel et acquérez les 40 dernières secondes de données.
   7. Une fois le balayage accéléré terminé, effectuez un balayage final du spectre d’émission de fluorescence en utilisant des paramètres identiques, comme indiqué à l’étape 1.3.

Matériaux