Essai de coincubation pour l’étude des interactions compétitives entre souches bactériennes

Résumé

Source : Speare, L., et al. Essai de coïncubation pour quantifier les interactions compétitives entre les isolats de Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo présente un test de co-incubation utilisé pour étudier comment les souches bactériennes se font concurrence dans un environnement partagé. Il est largement utilisé en microbiologie pour identifier les mécanismes, tels que la destruction dépendante ou indépendante du contact, qui sont à l’origine de ces interactions.

Protocole

1. Souches en coïncubation (Figure 1B, C)
   1. Mélanger la souche de référence et la souche concurrente dans un rapport de 1:1 (v/v) en ajoutant 100 μL de chaque souche (normalisée à OD 1,0) dans un tube à centrifuger de 1,5 mL marqué. Comme témoin, mélanger la souche de référence avec une version d’elle-même étiquetée différentiellement (souche de référence pVSV102 + souche de référence pVSV208). Ce contrôle est nécessaire pour une analyse statistique ultérieure afin de déterminer si la présence d’une souche concurrente a un impact sur la croissance de la souche de référence. Vortex la culture à souches mixtes pendant 1-2 s.
      NOTE: Cette étape peut nécessiter une optimisation, car le rapport de départ peut avoir un impact significatif sur les résultats et doit être ajusté.
   2. Répétez l’étape 1 pour chaque répétition biologique. Après avoir terminé cette étape, il devrait y avoir un total de huit tubes de souches mixtes : quatre répétitions biologiques avec des souches de référence marquées différentiellement (témoin) et quatre répétitions biologiques avec des souches de référence et concurrentes marquées différentiellement (expérimentales).
   3. Placer 10 μL de chaque mélange témoin et expérimental sur des plaques de Pétri contenant de la gélose LBS ; Ces taches de culture seront utilisées pour la microscopie à fluorescence après l’incubation.
   4. Laissez les taches sécher complètement sur la paillasse jusqu’à ce que tout le liquide ait été absorbé dans l’agar, et incubez les plaques de Pétri à 24 °C pendant 24 h. Il faut au moins 15 h pour que les souches de V. fischeri marquées avec pVSV102 et pVSV208 atteignent une densité cellulaire suffisamment élevée pour visualiser la protéine fluorescente verte (GFP) et la protéine fluorescente rouge (RFP), respectivement, à l’échelle de la population à l’aide d’un microscope à dissection de fluorescence. Ici, nous utilisons une incubation de 24 h pour l’imagerie de points mixtes.
      NOTE: Il est important d’utiliser des assiettes qui ne sont ni trop humides ni trop sèches. Si les plaques sont trop humides, les taches de coïncubation ne seront pas absorbées par la plaque de gélose ; Évitez d’utiliser des assiettes versées le même jour. Si les plaques sont trop sèches, de petites vagues ou des fissures peuvent se former à la surface de la gélose, rendant les taches de coïncidation de forme irrégulière.

Résultats

Figure 1 : Organigramme illustrant le test de coïncubation. (A) Les souches bactériennes hébergeant soit le pVSV102 (souche de référence indiquée Souche Réf. ou R.S.), soit le souche pVSV208 (souche concurrente indiquée Souche Comp....

Matériaux