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1. Essai de placage
NOTE: Le test de placage mesure la concentration de cellules capables de générer une unité formant colonie (UFC) dans les échantillons de culture. Cette procédure révèle la vitesse à laquelle une cellule se divise en deux cellules viables et permet de détecter les arrêts de division cellulaire (par exemple, une augmentation du temps de génération bactérienne de la lyse cellulaire).
- Préparer des dilutions en série de 10 fois jusqu’à 10-7 des 200 μL d’échantillon de culture dans un milieu frais. Plaque de 100 μL de la dilution appropriée sur des plaques d’agarose Luria-Bertani (LB) non sélective pour obtenir entre 3 et 300 colonies après une nuit d’incubation à 37 °C.REMARQUE : La dilution en série dans un milieu frais doit être effectuée rapidement pour limiter les divisions bactériennes. Alternativement, les chercheurs pourraient envisager d’utiliser une solution saline sans source de carbone pour empêcher les divisions cellulaires pendant le processus de dilution.
- Le lendemain, comptez le nombre de colonies pour déterminer la concentration de cellules viables (UFC/ml) dans chaque échantillon de culture. Tracer la CFU/mL en fonction du temps pour les cultures de cellules non traitées et traitées.
2. Cytométrie en flux
NOTE: La section suivante décrit la préparation d’échantillons de cellules pour l’analyse par cytométrie en flux. Cette technique d’analyse révèle la distribution de la taille des cellules et du contenu en ADN pour un grand nombre de cellules. Dans la mesure du possible, il est recommandé de traiter immédiatement les échantillons de cytométrie en flux. Alternativement, les échantillons peuvent être conservés sur de la glace (jusqu’à 6 h) et analysés simultanément à la fin de la journée, une fois que le placage et l’imagerie microscopique ont été effectués.
- Diluer les 250 μL d’échantillon de culture pour obtenir 250 μL à une concentration de ~15 000 cellules/μL (correspondant à une DO600nm ~0,06) dans un milieu frais à 4 °C.
NOTE: L’incubation sur glace limitera la croissance et la modification morphologique des cellules. Alternativement, l’utilisateur peut envisager d’effectuer une fixation des cellules dans de l’éthanol à 75 %, comme cela est généralement recommandé pour la cytométrie en flux. - Pour la coloration de l’ADN, mélanger l’échantillon bactérien avec une solution de 10 μg/mL de colorant fluorescent d’ADN (rapport 1:1) et incuber dans l’obscurité pendant 15 minutes avant d’analyser l’échantillon.
- Passez l’échantillon dans le cytomètre en flux avec un débit de ~120 000 cellules/min. Obtenez de la lumière diffusée vers l’avant (FSC) et à diffusion latérale (SSC) ainsi qu’un signal de fluorescence de colorant fluorescent d’ADN (FL-1) avec les paramètres appropriés.
- Tracez les histogrammes de densité cellulaire FSC et FL-1 pour représenter la distribution de la taille des cellules et du contenu en ADN dans la population cellulaire.