Évolution adaptative de bactéries à l’aide d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes

Résumé

Source : Jian, X., et al., Culture microbienne automatisée et évolution adaptative à l’aide d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC). J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo démontre l’utilisation d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes pour favoriser l’évolution adaptative des bactéries vers la tolérance au méthanol. En mélangeant des cultures bactériennes modifiées avec un milieu à fort stress de méthanol et en les segmentant en microgouttelettes, le système sélectionne les mutants qui présentent une croissance améliorée sous stress de méthanol. Grâce à des cycles d’enrichissement itératifs et à l’isolement des colonies, des souches bactériennes adaptées au méthanol sont cultivées pour une analyse ou une application plus approfondie.

Protocole

Évolution adaptative dans MMC

1. Préparation de la solution bactérienne initiale
   1. Suivez les réglementations standard en vigueur pour préparer les plaques spéciales liquides, fluides et solides pour le MeSV2.2 et l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
   2. Cultivez le MeSV2.2 à l’aide de la plaque solide (diamètre = 90 mm) dans un incubateur à température constante à 37 °C pendant 72 h. Ensuite, choisissez une colonie indépendante et cultivez-la dans une fiole agitée de 50 mL avec 10 mL du milieu liquide spécial dans un incubateur à agitation (200 tr/min) à 37 °C pendant 72 h.
   3. Diluer la solution de culture de MeSV2.2 avec le milieu jusqu’à une DO₆₀₀ de 0,1-0,2 (veiller à ce que le volume total ne soit pas inférieur à 10 ml) et poursuivre la culture dans la fiole agitée pendant 5 h pour obtenir la solution bactérienne initiale.
      NOTE: Le MeSV2.2 est une souche d’E. coli essentielle au méthanol. Le milieu liquide spécial contient 500 mmol/L de méthanol, ce qui constitue un fort stress pour MeSV2.2, ce qui entraîne une croissance très lente.
2. Initialisez la MMC.
3. Sortez deux flacons de réactifs stérilisés, dont l’un est pour la solution bactérienne initiale et l’autre pour le milieu frais. Injectez la solution bactérienne initiale (5 ml), le milieu frais (12-15 ml) et l’huile MMC dans les flacons de réactifs.
   NOTE: Comme l’évolution adaptative est un processus à long terme impliquant plusieurs sous-cultures, stockez autant de milieu frais que possible dans la MMC. Le milieu ne peut pas être réapprovisionné pendant l’expérience.
4. Installez les deux flacons de réactif dans MMC. Installez l’un pour la solution bactérienne initiale entre les connecteurs C2 et O2 et l’autre pour le milieu frais entre les connecteurs C4 et O4.
5. Cliquez sur ALE pour choisir la fonction d’évolution adaptative (Figure 1B). Dans l’interface de réglage des paramètres, activez le commutateur de détection OD.

6. Définissez le nombre sur 50, la longueur d’onde sur 600 nm, la concentration sur 0 %, le type sur le temps, le paramètre sur 30 h et les répétitions sur 99. Cliquez sur Démarrer pour démarrer la génération de gouttelettes. Cela prendra environ 25 min.
   NOTE: Ici, la « concentration » fait référence à la concentration maximale de facteurs chimiques pour l’évolution adaptative. Pour différentes gouttelettes, il est possible d’introduire dans la MMC différentes concentrations de facteurs chimiques pour fournir différentes conditions de croissance. Calculez les concentrations introduites à l’aide de l’équation suivante :

   

   Ici, « C » fait référence à la concentration des facteurs chimiques introduits dans les gouttelettes ; « a » fait référence à la concentration des facteurs chimiques dans les flacons de réactif entre les connecteurs C4 et O4 ; « b » fait référence à la concentration des facteurs chimiques dans les flacons de réactif entre les connecteurs C6 et O6 ; et « i » fait référence à la concentration disponible. Il y a huit concentrations disponibles dans MMC. Étant donné que le facteur chimique a ici une concentration unique (500 mmol/L de méthanol) et qu’il est l’un des ingrédients du milieu, une seule bouteille de réactif contenant le facteur chimique est installée ici, et la concentration est fixée à 0 %. Le type fait référence au mode de sous-culture, qui est divisé en trois types : le mode temporel, le mode de valeur OD et le mode de fluorescence. Le premier signifie cultiver les gouttelettes pendant un temps fixe, puis les sous-cultiver, tandis que les deux derniers signifient cultiver les gouttelettes à une valeur OD/intensité de fluorescence prédéfinie, puis sous-cultiver. Le paramètre fait référence au paramètre associé requis lors du choix d’un mode de sous-culture. Les répétitions se réfèrent au nombre de sous-cultures.

7. Retirez le flacon de réactif placé entre les connecteurs C2 et O2.
8. Observez si les valeurs maximales de DO des gouttelettes au cours de chaque période de sous-culture ont augmenté de manière significative. Si l’augmentation se produit et répond aux exigences de l’expérience, cliquez sur le bouton Exporter les données pour exporter les données OD.
   REMARQUE : Ici, la période de sous-culture dépend du paramètre. Par exemple, lorsque vous définissez Type sur Temps et Paramètre sur 30 h, la période de sous-culture est de 30 h. Au cours de chaque période de sous-culture, il y a des valeurs maximales de DO des gouttelettes. Estimer si l’évolution adaptative répond aux exigences de l’expérience par l’augmentation des valeurs maximales de DO (l’augmentation dépend du processus de culture réel de la souche, par exemple, augmenté de plus de 20 %). ATTENTION : Faites attention à ce que le milieu frais stocké soit épuisé. Si l’augmentation significative ne s’est pas produite même après l’épuisement du substrat, extrayez les gouttelettes qui poussent le mieux et effectuez un nouveau cycle d’évolution adaptative.
9. Extrayez les gouttelettes cibles de la MMC.
   1. Cliquez sur le bouton Dépistage pour choisir la fonction d’extraction des gouttelettes (Figure 1C). Choisissez l’option Collecter, cliquez sur le nombre de gouttelettes cibles, puis cliquez sur OK.
      NOTE: Le criblage des gouttelettes comprend « Collecter », « Jeter » et « Extraire la solution de semence ». « Extraire la solution de semence » signifie collecter les gouttelettes restantes après l’opération de sous-culture.
   2. Attendez que la fenêtre contextuelle vous demande : « Veuillez retirer le connecteur rapide CF et le mettre dans le tube EP ». Insérez le connecteur rapide CF dans le tube de microcentrifugation pour le prélèvement conformément à l’invite du logiciel, puis cliquez sur OK (Figure 2D).
   3. Après 1 à 2 minutes, l’interface du logiciel apparaîtra dans une nouvelle fenêtre demandant : « Veuillez réinsérer le connecteur et cliquer sur OK si vous avez terminé ». Ensuite, réinsérez le connecteur rapide CF et cliquez sur OK pour que MMC continue de fonctionner (Figure 2D).
      NOTE: Une fois que toutes les gouttelettes cibles ont été collectées, le MMC continuera à cultiver les gouttelettes restantes. Si la culture n’est pas nécessaire, cliquez sur Arrêter pour mettre directement fin à l’opération.
   4. Extrayez la gouttelette à l’aide d’une pipette de 2,5 μL, déposez-la sur la plaque d’agarose de 90 mm et étalez-la uniformément à l’aide d’une tige d’épandage de verre triangulaire d’une longueur de côté de 3 cm. Ensuite, cultivez-le dans un incubateur à température constante de 37 °C pendant 72 h.
   5. Cueillir 3 à 5 colonies indépendantes et les cultiver séparément dans les flacons agitateurs de 50 mL avec 10 mL de milieu frais dans un incubateur à agiter (200 tr/min) à 37 °C pendant 48 à 72 h. Suivez les réglementations standard connexes pour stocker la solution de bactéries cultivées dans le tube de glycérol pour les expériences ultérieures.

Résultats

Figure 1 : interface du logiciel de fonctionnement de MMC. (A) L’interface principale du logiciel. (1) Température dans la chambre de fonctionnement. (2) Valeur du signal photoélectrique de la reconnaissance des gouttel...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Méthanol	MACKLIN	M813895	Composant du support spécial pour MeSV2.2.
Système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Effectuer la détermination de la courbe de croissance et l’évolution adaptative. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Puce microfluidique	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	Pour diverses opérations de gouttelettes. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/
Huile MMC	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	La phase huileuse pour la microfluidique des gouttelettes. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/
Pétri	Corning Incorporated	90 millimètre	Pour la préparation de milieu solide
Pipette	Eppendorf	2,5 μL, 10 μL, 100 μL, 1000 μL	Pour la manipulation de liquides
Connecteur rapide A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	Pour la connexion de chaque joint. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/
Flacon de réactif	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Échantillonnage et stockage de la solution bactérienne et des réactifs. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/
Fiole agitée	Union-Biotech	50 ml	Pour la culture microbienne
Incubateur à secousses	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	Pour la culture microbienne en gourde
Sulfate de streptomycine	Solarbio	S8290	Composant du support spécial pour MeSV2.2.
Seringue	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 ml	Prélevez le liquide et injectez-le dans le flacon de réactif
Aiguille de seringue	Quincaillerie OUBEL	22G	Le diamètre intérieur est de 0,41 mm et le diamètre extérieur est de 0,71 mm.