Préparation d’une plaque microfluidique avec des cellules bactériennes

Résumé

Source : Sutlief, A. L., et al. Analyse en cellules vivantes des contraintes de cisaillement sur Pseudomonas aeruginosa à l’aide d’un système microfluidique automatisé à plus haut débit. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo montre la préparation d’une plaque microfluidique pour les études de contraintes de cisaillement dans des cultures bactériennes. Après amorçage des canaux avec un milieu, des cellules bactériennes sont introduites dans le canal expérimental et incubées pour leur attachement. Les milieux résiduels et la culture sont retirés pour préparer le système aux expériences ultérieures de contraintes de cisaillement.

Protocole

1. Préparation aux médias

1. Préparez un minimum de milieux (MM) contenant 0,25 % de glucose. Pour obtenir 1 L de MM avec 0,25 % de glucose, ajoutez 200 mL de solution stérile de sel M9, 2 mL de sulfate de magnésium stérile de 1 M (MgSO₄), 100 μL de chlorure de calcium stérile de 1 M (CaCl₂) et 12,5 mL de glucose stérile à 20 % (p/v) dans l’eau (dH₂O) à un volume final de 1 L.
2. Transférez les médias nécessaires dans une bouteille stérile en utilisant des techniques stériles. Préparez la quantité requise en fonction du nombre de canaux utilisés. Typiquement, chaque canal nécessite 200 μL pour l’amorçage, 300 μL pour le semis et 1300 μL pour l’expérience de 24 heures.
3. Placez la bouteille dans un incubateur ou un bain-marie réglé à la température expérimentale. Le milieu doit être à la température de l’expérience avant l’utilisation afin d’éviter la formation de bulles dans les microcanaux.

2. Préparation d’une culture nocturne et expérimentale de la souche PA01 de Pseudomonas aeruginosa exprimant une protéine fluorescente verte améliorée (PA01-EGFP).

1. Placez 15 mL de milieux expérimentaux dans une fiole stérile de bras et inoculez avec une ou deux colonies d’une plaque d’agar striée de PA01-EGFP. Élargissez la culture pendant 12 à 16 heures sur une table incubatrice/shaker à 37 °C et 180-220 tr/min.
2. Mesurez le OD₆₀₀ de la culture nocturne. Lorsque le OD₆₀₀ est supérieur à 0,80, diluer la culture nocturne jusqu’à un OD final de 0,8 à l’aide de MM frais. Placer la culture expérimentale dans un incubateur ou un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que nécessaire soit nécessaire pour ensemencer les canaux microfluidiques. Vérifiez à nouveau l’OD₆₀₀ juste avant le semis pour vous assurer qu’il n’a pas changé de manière significative par rapport à la cible OD₆₀₀, 0,8 dans ce cas.

3. Démarrage des équipements

1. Configurez la station système selon le guide utilisateur, similaire à la configuration de la Figure 1. Pour éviter toute erreur dans la connexion de l’instrument au logiciel, allumez l’instrument dans l’ordre suivant :
   Station de travail PC
   Module de fluorescence. Assurez-vous que l’obturateur à fluorescence est ALLUMÉ (lumière bleue près du bouton de l’obturateur allumée)
   Contrôleurs matériels
   Contrôleur de système d’imagerie (voir Tableau des matériaux)
   Caméra CCD
   Station d’imagerie (microscope)
   REMARQUE : La température de la plaque chauffée doit être ajustée à la température expérimentale souhaitée.
2. Commencez l’application de contrôle et entrez le numéro de plaque situé sur l’étiquette sur le côté de la plaque.
   REMARQUE : Après le lancement de l’application de contrôle, il y aura deux fenêtres distinctes : une pour le logiciel qui contrôle le microscope/logiciel d’imagerie et une pour le module de contrôle qui contrôle la pompe et l’interface de la plaque de puits.

4. Amorçage et ensemencement de la plaque microfluidique

REMARQUE : L’amorcement, l’implantation, l’attachement bactérien et la croissance sont illustrés à la Figure 2.

1. Retirez la plaque microfluidique à 48 puits de l’emballage en veillant à ne pas toucher la surface vitrée au bas de la plaque. Nettoyez bien la glissière en verre au fond de la plaque avec un mouchoir de verre, un chiffon sans peluches ou une lingette à faible intensité.
2. Pour amorcer les canaux microfluidiques, pipettez 200 μL de 37 °C MM dans le puits de sortie, en veillant à éviter les bulles. Placez la plaque dans l’étage de la plaque et essuyez l’interface avec de l’éthanol, la laissant sécher, avant de la sceller sur l’étage de la plaque.
3. En mode manuel sur le module de contrôle, réglez Fluide comme
   Luria-bertani (LB) à 37 °C et Cisaillement maximal à 5,00 dyne/^{cm 2}. Cliquez sur les puits de sortie pour activer le flux de la sortie vers le puits d’entrée, en amorçant les canaux. Après la préparation de 5 minutes, mettez le flux en pause pour préparer le semis. Retirez soigneusement la plaque de l’étage et pipettez les résidus de la sortie, mais ne retirez aucun milieu du cercle intérieur menant aux canaux microfluidiques.
4. Pour ensemencer les canaux expérimentaux, on pipete d’abord 300 μL de MM dans le puits d’entrée, puis on pipette 300 μL de la culture bactérienne dans le puits de sortie dans le puits de sortie. Remettez la plaque dans l’étape de la plaque, en veillant à bien nettoyer l’interface avant de la poser sur la plaque.
5. Sur le module de contrôle, concentrez-vous sur un seul canal en utilisant le flux de caméra en direct après avoir placé l’étage de plaque sur l’étage du microscope. Lors du suivi visuel par le flux en direct, reprenez le débit à 1,00-2,00 dyne/cm² pendant environ 2 à 4 s afin de permettre aux cellules d’entrer dans le canal expérimental, mais pas dans les canaux serpentins. Laissez la plaque sur l’étage à température contrôlée pendant 1 h pour permettre l’attache des cellules. Pendant l’incubation d’une heure, le module de contrôle et le logiciel Montage peuvent être configurés pour l’autorun.
   REMARQUE : Le temps nécessaire pour l’ensemencement varie selon le milieu et l’organisme, il doit donc être suivi de près par le flux vivant jusqu’à optimisation et utilisé comme un délai général. Le smashage sur toute la plaque peut varier, ce qui nécessiterait plus de temps pour que l’application s’écoule vers certaines colonnes de canaux afin de terminer le semis.
6. Après la période d’attachement, retirez doucement la plaque de l’étage et pipettez d’abord les bactéries de la sortie, évitant de perturber le canal. Avec une nouvelle pointe de pipette, retirez le média des puits d’entrée.

Résultats

Figure 1 : Composants individuels du système microfluidique. Les composants individuels sont listés de gauche à droite : 1. Caméra CCD, 2. Microscope inversé haute résolution avec étage automatisé, module de fluorescence automatisé et modul...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure d’ammonium, ACS	VWR	BDH9208-500G	Partie de la composition minimale des médias
Plaque de cisaillement faible à 48 puits BioFlux 1000	Fluxion Biosciences	910-0047
Système d’imagerie microfluidique BioFlux 1000Z	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
Dihydrure de chlorure de calcium, grade ACD	VWR	97061-904	Partie de la composition minimale des médias
Dextrose, anhydre, ACS	VWR	BDH9230-500G	Partie de la composition minimale des médias
Sulfate de magnésium de qualité ACS	VWR	EM-MX0070-1	Partie de la composition minimale des médias
Phosphate de potassium monobasique, grade ACS	VWR	BDH9268-500G	Partie de la composition minimale des médias
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	Souche bactérienne de Pseudomonas aeurinosa PA01 avec modification GFP utilisée pour cette étude.
Chlorure de sodium, ACS	VWR	BDH9286-500G	Partie de la composition minimale des médias
Phosphate de sodium, monobasique, anhydre, qualité réactif	VWR	97061-942	Partie de la composition minimale des médias