Article de méthode

Protocole pour vaccins recombinants contre le SRAS RBD-base: préparation de protéines, vaccination des animaux et de détection de neutralisation

DOI :

10.3791/2444

⸱

2 mai 2011

 ,  ,  , 
1Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une procédure générale pour l'étude de liaison au récepteur recombinant domaine (RBD) basé vaccins sous-unitaires contre le SRAS. Il inclut des méthodes pour la transfection et l'expression des protéines dans les cellules 293T RBD, l'immunisation de souris avec RBD et la détection de l'activité de neutralisation de sérums de souris en utilisant un dosage établie SRAS neutralisation pseudovirus.

Résumé

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Basé sur leur profil d'innocuité et sa capacité à induire des réponses immunitaires contre les infections, vaccins sous-unitaires ont été utilisés comme des candidats pour une grande variété de pathogènes 1-3. Puisque le système de cellules de mammifères est capable de modifications post-traductionnelles, formant ainsi des protéines correctement repliées et glycosylée, protéines recombinantes exprimées dans les cellules de mammifères ont montré le plus grand potentiel pour maintenir l'antigénicité et l'immunogénicité élevée 4-6.

Bien qu'aucun nouveau cas de SRAS ont été rapportés depuis 2004, de futures éclosions sont une menace constante, par conséquent, le développement de vaccins contre le SRAS-CoV est une étape prudente et préventive doit être effectuée. Les RBD de la protéine S SRAS-CoV joue un rôle important dans la liaison aux récepteurs spécifiques et l'induction d'anticorps neutralisants contre 7-9 infection par le virus. Par conséquent, dans ce protocole, nous décrivons de nouvelles méthodes pour développer un vaccin sous-unité RBD-Unis contre le SRAS. En bref, la protéine recombinante RBD (rRBD) a été exprimée dans le surnageant de culture de cellules de mammifères 293T d'obtenir une protéine correctement repliée avec une conformation correcte et l'immunogénicité élevée 6. La transfection du recombinant plasmide codant pour RBD aux cellules a été ensuite effectuée en utilisant une méthode de transfection de phosphate de calcium 6,10 avec quelques modifications. Comparativement à la méthode de transfection des lipides 11,12, cette méthode de calcium de phosphate modifiés transfection est moins cher, plus facile à manipuler, et a le potentiel pour atteindre une grande efficacité une fois complexes de transfection avec une taille convenable et la forme est formée 13,14. Enfin, un test de neutralisation du SRAS pseudovirus été introduite dans le protocole et utilisé pour détecter l'activité neutralisante des sérums de souris vaccinées avec la protéine rRBD. Ce dosage est relativement sûr, n'implique pas une maladie infectieuse du SRAS-CoV, et peut être effectuée sans l'exigence d'un laboratoire de biosécurité 3 15.

Le protocole décrit ici peut également être utilisé pour la conception et l'étude des vaccins sous-unitaires recombinants contre d'autres virus avec des protéines de fusion de classe I, par exemple, le VIH, le virus respiratoire syncytial (VRS), virus Ebola, virus de la grippe, ainsi que les virus Nipah et Handra. En outre, les méthodes pour générer une pseudovirus et ensuite établir un test de neutralisation pseudovirus peut être appliquée à tous ces virus.

Protocole

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1. Recombinante Préparation du SARS-CoV protéines RBD

  1. Préparer réactif de transfection de phosphate de calcium
    1. Préparation de 2X tampon HBS: Mélanger 16 g de NaCl, 0,4 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, et 13,0 g d'HEPES. Ajuster le pH à 7,00 et amener le volume total à 1000 ml d'eau distillée. Après filtration de la solution pour la stérilisation, aliquote et le stocker à -20 ° C.
      Astuce: Toute variation de la valeur du pH aurait une incidence sur les résultats de la transfection. Ainsi, il est conseillé de tester plusieurs valeurs de pH autour de 7,00 (par exemple, 6,99, 7,00, ou 7,01) et de trouver le meilleur pour la transfection en utilisant la méthode présentée ci-dessous.
    2. 2,5 M CaCl 2 préparation: Ajouter 73,5 g de CaCl 2 * 2H 2 O à l'eau distillée dans un volume final de 200 ml. Filtrer la solution et conserver à -20 ° C.
  2. Recombinant transfection plasmidique et purification des protéines recombinantes
    1. Fractionner les cellules 293T à 50-70% de confluence 24 h avant la transfection. Cultiver des cellules de T-175 cm 2 flacons de culture tissulaire dans 40 ml de DMEM contenant 10% inactivés par la chaleur (HI) FBS et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) à 37 ° C dans 5% de CO 2.
    2. Tous les réactifs de transfection devrait être porté à la température ambiante avant la transfection. Ces réactifs comprennent 2X HBS, 2.5M CaCl 2, Dih 2 O, et rRBD 6 plasmide.
      Astuce: Le plasmide final recombinant de construction utilisé pour l'expression protéique doit contenir un peptide signal pour assurer la sécrétion de protéines recombinantes exprimées dans le surnageant de culture. Un 6x Son étiquette peut être ajoutée à la C-terminale de la protéine exprimée pour la purification facile.
    3. Préparer un 50 ml (A) et un 15 ml (B) BD Falcon tube, et ajouter des réactifs dans les tubes comme indiqué dans le tableau 1. Ajouter 2X tampon HBS à A. Dans le tube tube B, ajouter 2,5 M CaCl 2 et rRBD plasmide, et de porter le volume à l'exigence de Dih 2 O.
      A. Un T-175 cm 2 flacon de culture tissulaire (4000 ul / flacon): se préparer pour l'expression rRBD
      Un tube Le tube B
      2X HBS 2000 uL 2,5 M CaCl 2 200 uL
      rRBD ADN plasmidique 40 ug
      Dih 2 O 2000 uL
      B. Une de 100 mm boîte de Petri (1000 ul / plat): se préparer pour la production pseudovirus SRAS
      Un tube Le tube B
      2X HBS 500 ul 2,5 M CaCl 2 50 ul
      ADN plasmidique S SRAS-CoV 5 ug
      VIH-1 plasmide (pNL4-3.luc.RE) 5 ug
      Dih 2 O 500 ul
      Tableau 1. Préparation du mélange de transfection et les volumes
      Les volumes indiqués dans le tableau 1 sont pour une unité de transfection. Si plus des flacons ou des plats sont utilisés pour la transfection, ajuster les volumes en conséquence.
    4. Ajouter la solution d'ADN et de calcium dans le tube B dans le tube A dans un goutte à goutte, tout en maintenant constante et douce de mélange dans un tourbillon. Laissez reposer le mélange à la température ambiante pendant 20-30 min. La clé pour la transfection de phosphate de calcium succès dépend de la taille et la forme du précipité formé. Ainsi, le mélange doit être constamment vortexé et lentement pour répondre à cette exigence et, par conséquent, d'améliorer l'efficacité de la transfection.
    5. Ajouter le mélange goutte à goutte, et même dans les cellules 293T (4000 ul / flacon). Cellules en culture dans un incubateur à 37 ° C dans 5% de CO 2.
    6. Remplacez le milieu de culture avec des produits frais sans sérum OPTI-MEM-je réduite Sérum Medium (50 ml / flacon) 8-10 h post-transfection. Continuer à cultiver des cellules pour deux jours de plus dans le même état.
    7. Recueillir le surnageant contenant la protéine exprimée rRBD 72 h post-transfection. Centrifuger à 6000 rpm pendant 15 min pour éliminer les débris cellulaires. Ajouter un cocktail inhibiteur de protéase pour le surnageant collecté et stocker à 4 ° C pendant la nuit.
    8. Le lendemain, purifier rRBD protéine recombinante à partir du surnageant de culture en utilisant les instructions du fabricant Superflow Ni-NTA suivante.
    9. Concentré protéine purifiée en utilisant des tubes ultra concentration Amicon -15. Après la concentration de protéines,Ajouter PBS à la concentration des tubes et centrifuger à nouveau pour enlever l'imidazole dans le tampon d'élution. Calculer la concentration de protéines et de stocker des protéines purifiées à -80 ° C jusqu'à utilisation.

2. Immunisation de souris et de prélèvement d'échantillons

  1. Préchauffer Sigma adjuvant System (SAS) à 40-45 ° C selon les instructions du fabricant. Ajouter 1 ml de PBS par flacon et bien mélanger.
  2. Préparer protéines adjuvant émulsion selon le protocole dans le tableau 2. Pipeter calculée protéines rRBD dans un tube de 1,5 ml. Ajouter un volume égal de SAS adjuvant dans le tube et vortexer vigoureusement pendant 2-3 min pour former l'émulsion.
    Astuce: Les volumes indiqués dans le tableau 2 sont pour une souris. Ajustez le volume en fonction du nombre de souris utilisées réelle. Pour chaque groupe, mélanger les protéines et de l'adjuvant nécessaire pour chaque vaccin. Toujours préparer un échantillon supplémentaire pour la vaccination pour assurer l'exactitude.
    Groupe 1 er vaccins
    (200 ul / souris)     		2 ème vaccin
    (200 ul / souris)     		3 ème vaccin
    (200 ul / souris)
    protéines rRBD 20 g de protéine dans du PBS
    (100 ul) + 100 uL SAS     		10 g de protéine dans du PBS (100 ul) + 100 uL SAS 10 g de protéine dans du PBS (100 ul) + 100 uL SAS
    PBS de contrôle 100 ul de PBS +
    100 uL SAS     		100 ul de PBS +
    100 uL SAS     		100 ul de PBS +
    100 uL SAS
    Tableau 2. Protocole d'immunisation de la souris
  3. Sous-cutanée en prime-vacciner les femmes souris Balb / c (4-6 semaines, 5 souris / groupe), et de stimuler deux fois avec rRBD et SAS comme indiqué au tableau 2. Utilisez PBS groupe comme le contrôle. Le site d'injections sous-cutanées généralement choisi est la peau lâche entre les omoplates. Alternativement, l'abdomen ventral est couramment utilisé, car il est plus facile à injecter, et peut observer des fuites provenant des sites d'injection. Lorsque des doses répétées de vaccins sont utilisés, il est facile de sélectionner des sites d'injection différents, empêchant le potentiel des réactions cutanées locales.
  4. Purger souris par rétro-orbitale avec anesthésie avant l'immunisation et 10 jours après chaque vaccination, et la chaleur des sérums à 56 ° C pendant 30 min pour inactiver le complément. Magasin de sérums de souris à -20 ° C jusqu'à utilisation.

3. Détection de neutralisation utilisant test de neutralisation pseudovirus

  1. Préparer pseudovirus SRAS
    1. Fractionner les cellules 293T en 100 mm plats de Pétri de culture tissulaire (2x10 6 cellules / boîte) 16 h avant la transfection, et cultiver des cellules comme ci-dessus.
    2. Préparer des réactifs de transfection, comme indiqué dans le tableau 1. Co-transfection un plasmide codant pour le SRAS-CoV protéine S et d'un plasmide codant pour Env-défectueux, la luciférase exprimant génome VIH-1 (pNL4-3.luc.RE) en utilisant le réactif de transfection de phosphate de calcium.
    3. Remplacer moyenne avec 10 ml DMEM frais contenant 10% de FBS et 1% P / S 8-10 h post-transfection. Recueillir le surnageant contenant pseudovirus SRAS 72 h post-transfection.
    4. Pseudovirus Filtrer à travers un filtre de 0,45 um. Aliquoter et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Dosage de SRAS neutralisation pseudovirus
    1. Fractionner les cellules 293T exprimant des récepteurs du SARS-CoV ACE2 (ACE2/293T) à 10 4 cellules/100 ul / puits de plaques de 96 puits de culture de tissus 16 h avant l'infection.
    2. Diluer pseudovirus SRAS en deux volets afin de détecter le titre du virus dans les cellules ACE2/293T.
    3. Série diluer sérums de souris dans les plaques de 96 puits de culture tissulaire, et ajouter un volume égal de pseudovirus SRAS titré. Préincuber les plaques à 37 ° C pendant 1 h.
    4. Après incubation, ajouter 100 ul du mélange de sérums-pseudovirus aux cellules ACE2/293T, et de continuer à cultiver des cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2. Ajouter DMEM frais 24 h plus tard.
    5. Supprimer complètement les surnageants de culture à partir des plaques de 72 h post-infection. Ajouter 1X réactif luciférase lyse cellulaire de la culture (60 ul / puits), et de promouvoir la lyse cellulaire avec agitation constante de plaques pendant 1-2 heures à température ambiante.
    6. Lysats de cellules de transfert (50 ul / puits) en plaques luminomètre (Microfluor plaques de 96 puits). Ajouter un substrat luciférase (50 ul / puits) inclus dans le système de dosage de la luciférase, et de détecter relativement activité luciférase dans les Ultra 384 luminomètre.
    7. Calculer titre SRAS neutralisation pseudovirus et présents sous le titre d'anticorps neutralisant 50% (NT 50) 6.

Discussion

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La densité cellulaire est un facteur important affectant l'efficacité du phosphate de calcium à base de transfection. Dans notre expérience, moins de 70% de confluence des cellules apporte les meilleurs résultats. Ainsi, afin d'améliorer l'efficacité de transfection, il est recommandé que la densité cellulaire sera maintenu à environ 50-70% de confluence. La méthode de transfection de phosphate de calcium est généralement considéré comme moins efficace par rapport aux méthodes de transfection d'autres, tels que 16 transfection des lipides. Toutefois, dans ce protocole, nous avons utilisé une méthode de calcium de phosphate modifiés transfection lequel constante et lente de mélange de la solution de transfection dans un vortex assure la formation d'un précipité avec la taille et de forme appropriées, améliorant ainsi l'efficacité de la transfection.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health (NIH) des États-Unis (RO1 AI68002).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
NaClSigma-AldrichS7653
Na2HPO4*7H2OSigma-AldrichS2429
HEPESSigma-AldrichH3375
CaCl2*2H2OSigma-AldrichC5080
DMEMInvitrogen12430
SFBS inactivéInvitrogen10438
Pénicilline/StreptomycineInvitrogen15140
Milieu OPTI-MEM IInvitrogen31985
Cocktail d'inhibiteurs de protéaseRoche Group11836170001
Ni-NTA SuperflowQiagen30450
Système adjuvant SigmaSigma-AldrichS6322
Système de dosage de la luciférasePromega Corp.E1501
Réactif de lyse pour culture cellulaire à la luciférase (5X)Promega Corp.E1531
Amicon Ultra - 15EMD MilliporeUFC901024
Plaques Microfluor 96-puitsThermo Fisher Scientific, Inc.7905
Luminomètre Ultra 384Tecan Group Ltd.

Références

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  1. Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).
  2. Tait, A., Hall, F. R. Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines. Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).
  3. Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270. Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).
  4. Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
  5. Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).
  6. Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity. Virology. 393, 144-150 (2009).
  7. Ambrosino, D. M. Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor. J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).
  8. Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 426, 450-454 (2003).
  9. He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).
  10. Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection. Gene. 270, 61-68 (2001).
  11. Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents. BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).
  12. Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
  13. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
  14. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  15. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, 140-149 (2004).
  16. Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).

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Mots-clés

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