Modèle in vitro à flux parallèle de plaques pour étudier l’adhésion bactérienne lors d’une biopsie tissulaire

Résumé

Source : Ditkowski, B., et al. Un modèle in vitro d’un système de perfusion à plaques parallèles pour étudier l’adhésion bactérienne aux tissus greffés. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo démontre la méthode d’utilisation d’une chambre de flux à plaques parallèles pour perfuser des bactéries marquées fluorescentement sur les tissus de greffe vasculaire, permettant une analyse contrôlée de l’adhésion bactérienne et de la pathogénie précoce en conditions de cisaillement.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animal approprié.1. Expériences de perfusion in vitro utilisant une chambre de flux à plaques parallèles

1. Montez des biopsies tissulaires de 10 mm de diamètre et de la même épaisseur dans un système de chambre de flux avec la surface interne orientée vers le haut pour entrer en contact avec la suspension bactérienne.
   REMARQUE : La même épaisseur de tissu sur différents greffons garantit que la même hauteur tissulaire est atteinte dans le canal, permettant un flux laminaire dans toutes les conditions. Tous les éléments de la chambre d’écoulement sont présentés et décrits dans la Figure 1.
   1. Pour commencer le protocole, placez la pièce de tissu ronde entre une lame de microscope avec une perforation circulaire de 8 mm et un joint en caoutchouc.
      REMARQUE : La lame de microscope possède un film inférieur ultra-fin permettant la génération du trou de 8 mm. Avec la feuille en caoutchouc, elle fixe le tissu pour permettre le contact direct entre l’échantillon et le milieu en mouvement et empêche également la luxation de la biopsie pendant l’expérience. La surface du tissu étudié, exposée au flux (diamètre plus petit), ne peut pas être manipulée par les pinces.
      1. Insérez le support avec le mouchoir dans la feuille de joint intégrée dans le cadre métallique inférieur de la chambre.
      2. Fixez le cadre métallique supérieur avec la plaque de joint correspondante sur la partie inférieure de la chambre avec le support de mouchoir précédemment inséré. Montez ensuite toute la chambre avec huit vis et des écrous à vis. Assurez-vous que la hauteur de la chambre reste toujours la même entre les greffons.
         REMARQUE : La hauteur de la chambre doit toujours être déterminée lors du serrage des vis. Utilisez un pied à coulisse ou une règle.
2. Reliez la chambre d’écoulement à une pompe péristaltique et le réservoir de fluide aux tubes.
3. Perfusez les tissus avec des suspensions de 10^unités CFU/mL (vérifiées par comptage de l’unité formatrice de colonies (CFU) et liées aux mesures OD₆₀₀ (densité optique)) marquées fluorescentement dans des PBS (sérum tampon phosphate) avec une contrainte de cisaillement de 3 dyne/cm² (dyne par unité de pression centimétrique carré) au moyen de la pompe péristaltique (débit 4 mL/min) pendant 1 h à l’aide d’un réservoir bactérien de 400 mL (conception interne, Figure 1) conditionné à 37 °C à l’aide d’un thermostat à plaques (Table of Materials).
4. Recirculez en continu la suspension bactérienne de 100 mL en utilisant le même réservoir de collecte.
5. Après la perfusion, démontez la chambre pour libérer le greffon et lavez le morceau de tissu deux fois avec 4 mL de PBS dans une plaque à 12 puits à l’aide du shaker orbital de laboratoire pendant 3 minutes chacun. Par la suite, découpez la partie interne de la greffe à l’aide d’une biopsie cutanée de diamètre plus petit.
6. Placez chaque biopsie tissulaire dans un tube séparé de 14 mL contenant 1 mL de NaCl stérile à 0,9 %. Étiquetez le tube comme #1.
7. Détacher les bactéries du tissu à l’aide d’un bain de sonication pendant 10 minutes (amplitude = 100 % et fréquence = 45 kHz).
   REMARQUE : Le décollement complet des bactéries des greffes tissulaires doit être évalué lors de l’incubation des patchs pendant la nuit à 37 °C dans un milieu liquide TSB (bouillon de soja tryptique), suivi de mesures OD₆₀₀ comparées aux patchs témoins traités avec une solution sans bactéries.

Résultats

Figure 1 : Image d’un système de chambre d’écoulement nouvellement développé (conception interne). A. Le jeu de flux monté dans la chambre d’écoulement (1) de dimensions LxEsque x Acque : 125 mm x 55 mm x 18 mm (des vis combinées à des écro...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Patch péricarde bovin (BP), péricarde péri-garde souple	Synovis Surgical Innovations, États-Unis	PC-0404SN
Conduits de la veine jugulaire bovine (BJV)	conduit Contegra ; Medtronic Inc, États-Unis	M333105D001
Homogreffe cryopréservée CH	Banque européenne d’homogreffe (EHB)	-
Acu-Punch	Acuderm Inc, États-Unis	P850 (8 mm) ; P1050 (10 mm)
Albumine humaine	Flexbumin ; Baxter, Belgique	BE171464LOT :16G12C
Bouillon de soja tryptique (TSB)	Fluka, Steinheim, Allemagne	22092-500G
Bouillon d’infusion cardiaque (BHI)	Fluka	53286-500G
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS).	Gibco	14190-094
5(6)-Ester de carboxyfluorescéine N-hydroxysuccinimide (FC)	Sigma-Aldrich, Allemagne	21878-100MG-F
Pompe péristaltique (MODÈLE ISM444B)	Ismatec BVP-Z Standard ; Cole Parmer, Wertheim, Allemagne	631942-2
Bain à sonnerie	Nettoyeur ultrasonore VWR ; VWR, Radnor, Pennsylvanie	142-6044	230V/50 -60Hz 60VA ; HF45kHz, 30W
Montage antifade en or ProLong	Invitrogen par ThermoFisher	P36930
Arium Pro VF - eau ultrapure - H2O MilliQ	Millipore	87206462
Lames microscopiques - Chambres de culture tissulaire (1-puits)	Sarstedt	94.6140.102
1-puits détachable sur Lumox	Sarstedt	94.6150.101
Acier inoxydable - lames chirurgicales	Swann-Morton	311
Tubulure en silicone Tygon, diamètre de 1/8 » x 1/4 » de diamètre	Cole-Parmer	EW-95702-06	Plage de température : –80 à 200°C Tériliser : Avec oxyde d’éthylène, irradiation gamma ou autoclave pendant 30 minutes, 15 psi de pression
Tubage BPT PharMed	Saint-Gobain	AY242012	Autoclavable 30 min à 121°C
Tubulure Tygon LMT-55	Saint Gobain Performance Plastics™	15312022
Thermostat	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230V, 90VA, 50Hz