Ce protocole décrit une procédure pour étudier la respiration des mitochondries isolées de muscles squelettiques. Cette méthode a été adaptée à partir Scorrano Et al. (2007). La procédure d'isolement des mitochondries nécessite environ 2 heures. La respiration mitochondriale peut être complété en environ 1 heure.
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Article de méthode
Isolement mitochondriale du muscle squelettique
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les mitochondries sont des organites le contrôle de la vie et la mort de la cellule. Ils participent à des réactions métaboliques clés, synthétiser plus de l'ATP, et de réglementer un certain nombre de cascades de signalisation 2,3. Les chercheurs actuels et passés ont mitochondries isolées à partir des tissus de rats et de souris, comme le foie, le cerveau et le coeur 4,5. Ces dernières années, de nombreux chercheurs se sont concentrés sur l'étude de la fonction mitochondriale des muscles squelettiques.
Ici, nous décrivons une méthode que nous avons utilisé avec succès pour l'isolement des mitochondries des muscles squelettiques 6. Notre procédure exige que tous les tampons et les réactifs sont frais et ont besoin d'environ 250-500 mg de muscle squelettique. Nous avons étudié les mitochondries isolées de rat et de souris gastrocnémien et le diaphragme et les muscles extraoculaires chez le rat. Concentration de la protéine mitochondriale est mesurée avec le dosage de Bradford. Il est important que les échantillons mitochondriale être conservés glacée pendant la préparation et que des études fonctionnelles être effectuée dans un temps relativement court (~ 1 h). Respiration mitochondriale est mesurée en utilisant la polarographie avec une électrode de type Clark (système oxygraphe) à 37 ° C 7. Calibrage de l'électrode à oxygène est une étape clé dans ce protocole et elle doit être effectuée quotidiennement. Mitochondries isolées (150 ug) sont ajoutés à 0,5 ml de tampon expérimental (EB). Etat 2 la respiration commence avec l'ajout de glutamate (5mm) et malate (2,5 mM). Ensuite, l'adénosine diphosphate (ADP) (150 uM) est ajouté pour commencer l'état 3. Oligomycine (1 pM), un bloqueur synthase ATPase, est utilisé pour estimer l'état 4. Enfin, le cyanure de p-carbonyle [trifluorométhoxy]-phényl-hydrazone (FCCP, 0,2 M) est ajouté à measurestate 5, ou la respiration découplée 6. Le ratio de contrôle respiratoire (RCR), le ratio de l'état 3 à l'état 4, est calculé après chaque expérience. Un RCR ≥ 4 est considéré comme une preuve d'une préparation viables mitochondries.
En résumé, nous présentons une méthode pour l'isolement des mitochondries viables à partir des muscles squelettiques qui peuvent être utilisés dans biochimiques (par exemple une activité enzymatique, immunodétection, protéomique), des études et fonctionnels (respiration mitochondriale).
Protocole
1. Préparation des tampons
- Allumez 5804R centrifugeuse et fixé à 4 ° C. Tourner sur le bain d'eau Isotemp 3006D et mettre à 37 ° C.
- Préparer les solutions suivantes avant l'isolement du muscle:
- PBS: dissoudre tampon phosphate salin (PBS) comprimés dans de l'eau distillée (5 comprimés / litre). Mélangez bien.
- PBS + 10 mM EDTA: Pour préparer une solution de 100 ml, ajouter 2 ml d'EDTA 500 mM à 98 ml de PBS.
- 8X tampon Mitochondries: 10,28 g de saccharose pour une concentration finale de 0,6 M, 400 mg d'acides gras libres de sérum albumine bovine (BSA) pour une concentration finale de 0,8%, 2,08 g d'HEPES pour une concent....
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Discussion
Nous présentons un protocole pour isoler les mitochondries viables à partir des muscles squelettiques. Si le rendement est un problème, le protocole peut être modifié en incubant le muscle isolé dans 5 ml de trypsine EDTA/0.01% PBS/10mM pendant 30 minutes dans la glace. Pour assurer la digestion complète du muscle à la trypsine, le muscle doit être pleinement hachée. Après l'incubation de 30 minutes, la solution de trypsine PBS/10mM EDTA/0.01% doit être entièrement remplacé par 3 ml de tampon d'isolement 1 (IB1).......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Institut national des yeux (R01 EY12998) à FH Andrade.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 95 % CO2 / 5 % O2 mélange | Fournisseur local de gaz | ||
| Adénosine 5′-diphosphate de sodium | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Papier filtre bleu Rizla | Hansatech | 890101 | |
| Dosage protéique de Bradford | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanure de p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifugeuse 5804R | Eppendorf | ||
| Azote comprimé | Fournisseur local de gaz | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Acide éthylène-glycol-bis-tétraacétique (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Albumine de sérum bovin liée aux acides gras libres | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Acide glutamique | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| Sel de sodium de HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Chlorure de magnésium | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Rats mâles Sprague Dawley | Harlan Laboratories | 300-500 g | |
| Acide malique | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycine | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Disque d'électrode à oxygène | Hansatech | S1 | |
| Oxygraphe | Hansatech | ||
| Logiciel Oxygraph Plus V1.01 | Hansatech | ||
| Ph-mètre | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Chlorure de potassium | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Phosphate de potassium | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Homogénéisateurs Potter-Elvehjem | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| Mémbbrane en PTFE (0,0125 mm × 25 mm) | Hansatech | S4 | |
| Perceuse à colonne SKIL 3320 | Magasin de quincaillerie | ||
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S5016 |
Références
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S....
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Réimpressions et autorisations
