Un écran à haut débit pour la bioprospection minière activité cellulase à partir des bibliothèques métagénomique

Résumé

Ce protocole décrit un écran haut débit pour l'activité cellulolytique d'une banque métagénomique exprimé dans Escherichia coli. L'écran est la solution basée et hautement automatisé et utilise un pot de chimie dans des microplaques 384 puits avec la lecture finale comme une mesure d'absorbance.

Résumé

La cellulose, la source la plus abondante de carbone organique sur la planète, possède une vaste applications industrielles avec un accent croissant sur ​​la production de biocarburants ^1. Les méthodes chimiques de modifier ou de dégrader la cellulose exigent généralement les acides forts et des températures élevées. En tant que tel, les méthodes enzymatiques sont devenus importants dans le processus de bioconversion. Alors que l'identification des cellulases actifs à partir d'isolats bactériens et fongiques a été quelque peu efficaces, la grande majorité des microbes dans la nature résister à la culture en laboratoire. Génomique environnementale, aussi connu comme des approches métagénomique, de dépistage ont un grand potentiel pour combler le fossé de culture dans la recherche d'enzymes de bioconversion roman. Approches de dépistage métagénomique ont réussi à récupérer les cellulases roman d'environnements aussi variés que les sols ^{2, 3} buffles du rumen et l'intestin postérieur des termites ⁴ en utilisant des plaques d'agar carboxyméthylcellulose (CMC) tachés avec le Congo colorant rouge (basé sur la méthode de Teather et Wood ^5). Cependant, la méthode MCC est limité dans le débit, n'est pas quantitatif et manifeste un signal faible à ⁶ bruit. D'autres méthodes ont été signalés, mais ^7,8 chacun utiliser une plaque de gélose de base de test, qui est indésirable pour criblage à haut débit des grandes banques génomiques d'insertion. Nous présentons ici une solution à base d'écran pour l'activité cellulase en utilisant un dinitrophénol chromogène (DNP)-cellobioside substrat ^9. Notre bibliothèque a été cloné dans le contrôle pCC1 copie fosmide pour augmenter la sensibilité du dosage par induction du nombre de copies ^10. La méthode utilise un pot de chimie en microplaques 384 puits avec la lecture finale fournie comme une mesure d'absorbance. Cette lecture est quantitative, sensible et automatisé avec un débit allant jusqu'à 384 plaques 100X-même par jour en utilisant un gestionnaire de liquide et de lecteur de plaque avec le système d'empilage ci-joint.

Protocole

Avant de commencer ce protocole, vous aurez besoin de votre banque métagénomique stockées dans un format de 384 plaque de bien. Dans notre étude, nous avons utilisé le vecteur pCC1 exemplaire de contrôle fosmide en combinaison avec le phage T1 résistant TransforMax EPI300-T1 ^R E. cellules coli comme hôte bibliothèque et stockées dans nos assiettes à -80 ° C ^11.

1. La réplication des plaques banque métagénomique

1. Décongeler les plaques contenant votre bibliothèque à 37 ° C pendant environ 20 minutes, ou jusqu'à ce que tous les puits sont décongelés.
2. Utilisez la fonction de la lumi....

Discussion

Un écran à haut débit pour la détection rapide de l'activité cellulolytique partir d'une bibliothèque génomique insérez métagénomique grandes ADN exprimée dans E. coli est décrite dans ce protocole. Cette méthode est une amélioration par rapport au dosage de CMC / rouge Congo couramment utilisé dans la littérature. C'est une solution basée, et permet pour un pot de dépistage chimie en plaques 384 puits, avec la sortie finale lectures d'absorbance à partir d'un lecteur de plaque permettant un.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
qPix2	Genetix		Avec tête de quadrillage à 384 broches
qFill3	Genetix		Avec collecteur à 384 puits
Varioskan	Thermo Fisher Scientific, Inc.
RapidStak	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Connecté à Varioskan
Micro90 Détergent	Cole-Parmer	18100-00	Dilué à 2 % dans l’eau
Éthanol	Principal fournisseur		Dilué à 80 % dans l’eau
Chloramphénicol	Sigma-Aldrich	C0378	12,5 mg/mL dans
bouillon d’éthanol LB, Miller	Fisher Scientific	BP1426-2	25 g/L, autoclave
Plaques à fond plat 384 puits	Corning	3680
L-(+)-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	100mg/mL dans l’eau
Acétate	de potassium Fisher Scientific	P171	50mM dans l’eau, autoclave, ajusté à pH 5,5 avec HCl
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Chlorhydrate de trizma	Sigma-Aldrich	T3253	Dans une solution tampon TE, 100 mM
sel disodique EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	Dans une solution tampon TE, 10 mM
de 2,4-dinitrophényl cellobioside			Fourni par le Dr Steve Withers, UBC
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418