Évaluation de l'inhibition de la propagation virale par le silençage génomique médié par des mimiques de microARN

Résumé

Source : Ruiz, A. J. et Russell, S. J. Régulation de la tropisme des picornavirus par ARN micro. J. Vis. Exp. (2017)

Ce vidéo montre l'utilisation de mimiques de microARN synthétiques afin d'inhiber de manière sélective la réplication virale dans des cellules épithéliales cultivées. Elle met en évidence comment la silenciation du génome dirigé par les microARN peut bloquer la propagation du virus et confirmer la spécificité du ciblage par une analyse de l'infectiosité en aval.

Protocole

1. Évaluation de la spécificité du ciblage par les microARN : test de propagation virale utilisant des analogues synthétiques de microARN

REMARQUE : L'utilisation d'un analogue synthétique de microARN est effectuée pour démontrer la spécificité de l'interaction microARN:cible du microARN.

1. Inclure des contrôles de transfection factice, de mimétique d'ARNm négatif et de mimétique d'ARNm expérimental uniquement pour chaque test afin d'évaluer la toxicité médiée par l'ARNm. Il est également recommandé d'inclure un témoin positif (c'est-à-dire un gène ou un génome ciblé par l'ARNm), car une faible efficacité de transfection des mimétiques d'ARNm peut entraîner des faux négatifs.
2. Ensemencer des cellules H1-HeLa dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits de manière à ce qu'elles soient confluentes à 80-90 % au moment de la transfection (24 h après l'ensemencement). Ensemencer les cellules en DMEM (milieu de type Eagle modifié de Dulbecco) complété avec 10 % de sérum de veau fœtal, à raison de 0,1 mL par puits.
   REMARQUE : Réaliser ce test sur des cellules perméables à la réplication virale et n'exprimant pas les microARN correspondants.
3. Porter les réactifs de transfection à température ambiante. Mélanger 9 µL de milieu sans sérum, une concentration finale de 200 nM par puits de stock de mimétique d'ARNm, 0,18 µL de réactif d'appoint, 0,18 µL de réactif de transfection, puis homogénéiser. Incuber le mélange à température ambiante pendant 2 à 5 minutes.
   REMARQUE : Les volumes indiqués sont par puits. Il est recommandé de préparer un mélange maître pour la transfection de tous les puits afin d'assurer l'uniformité et de minimiser les erreurs de pipetage. La concentration optimale du mimétique d'ARNm peut varier. Se référer aux instructions du fabricant fournies avec le mimétique d'ARNm pour une concentration initiale raisonnable, généralement comprise entre 5 et 200 nM.
4. Aspirer le milieu des puits et ajouter 92 µL de milieu complet frais.
   REMARQUE : Si le nombre d'échantillons est important, effectuer cette étape avant la préparation de la solution de transfection et conserver la plaque à 37 °C jusqu'à utilisation.
5. Ajouter délicatement, goutte à goutte, tout le mélange de transfection aux cellules.
6. Incuber à 37 °C pendant 6 h.
7. Infecter chaque puits à un faible MOI (multiplicité d'infection) afin de garantir qu'un faible pourcentage de cellules soit infecté, permettant ainsi l'analyse de la propagation du virus. Ce protocole utilise un MOI de 0,2.
   1. Diluer les stocks viraux dans du milieu sans sérum à une concentration de MOI = 0,2 par 100 µL. Retirer le milieu des puits et ajouter 100 µL de la dilution virale par puits.
   2. Incuber à 37 °C pendant 2 h.
8. Aspirer le milieu de chaque puits et ajouter 100 µL de milieu complet frais.
9. Incuber à 37 °C pendant 20 à 22 h.
10. Déterminer la titration virale dans les surnageants.
    1. Recueillir le surnageant de chaque puits et le remplacer par 100 µL de milieu complet frais.
       REMARQUE : Si des cellules en suspension sont utilisées, resuspendre le culot cellulaire obtenu à l'étape suivante dans 100 µL de milieu complet frais et le replacer dans le puits correspondant pour le test de viabilité.
    2. Éliminer les débris cellulaires des surnageants recueillis par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
    3. Transférer le surnageant clarifié dans un tube neuf et titrer le virus infectieux sur des cellules perméables n'exprimant pas les microARN correspondants. 
       REMARQUE : Conserver tous les échantillons sur glace pour éviter toute perte d'infectiosité.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Eau sans nucléase	Fisher Scientific	AM9938
Réactif de transfection TransIT-2020	Mirus	MIR 5404
Réactif de transfection TransIT-mRNA	Mirus	MIR 2225
Tubes de 2 mL avec bouchon à vis	Sarstedt	72.694.005
Mimétiques de microARN	Dharmacon	Varied
Dosage de la prolifération cellulaire MTT	ATCC	30-1010K