Production et récolte de cellules épithéliales thérapeutiques productrices de virus

Résumé

Source : Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxovirus pour l'immunomodulation ciblée des tumeurs : conception et évaluation ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Ce vidéo montre le processus d'infection de cellules épithéliales rénales avec des virus génétiquement modifiés afin de produire et de récolter ces derniers pour étudier la réplication virale.

Protocole

1. Détermination des capacités réplicatives et cytotoxiques de vecteurs viraux exprimant des immunomodulateurs

Comparer la cinétique de réplication du virus recombinant généré et du vecteur non modifié à l'aide de courbes de croissance en un seul ou en plusieurs pas (GC). Pour les GC en un seul pas, la descendance virale est évaluée après une infection simultanée de toutes les cellules (théoriquement, une infection à 100 %). Les GC en plusieurs pas démarrent avec un faible pourcentage de cellules infectées afin de suivre plusieurs cycles de réplication virale.

1. Pour l'analyse de la cinétique de réplication du virus de la rougeole, ensemencer 1 x 10⁵ cellules Vero dans 1 mL de DMEM (milieu de Dulbecco modifié) contenant 10 % de FBS (sérum de veau fœtal) par puits dans des plaques de 12 puits un jour avant l'infection. Placer au moins deux puits pour chaque point temporel d'intérêt en tant que réplicats techniques.
2. Infecter les cellules avec le virus à un faible MOI (multiplicité d'infection) pour les courbes de croissance en plusieurs étapes, ou à un MOI élevé pour les courbes de croissance en une étape (0,03 et 3 respectivement pour le virus MV ou virus de la rougeole) sur cellules Vero. Remplacer le milieu par 300 µL de milieu sans sérum contenant la quantité respective de virus et incuber à 37 °C et 5 % CO₂ pendant au moins 2 h. Retirer l'inoculum, ajouter 1 mL de DMEM avec 10 % de FBS, puis poursuivre l'incubation.
3. Aux points temporels pertinents, tels que 12, 24, 36, 48, 72 et 96 h après infection, récolter les progénies virales en raclant directement les cellules dans le milieu. Transférer le contenu de chaque puits dans un tube individuel, congeler rapidement dans l'azote liquide, puis stocker à -80 °C jusqu'au titrage.
   REMARQUE : Les échantillons réplicats peuvent être regroupés à cette étape pour l'analyse des titres moyens.
4. Collecter les échantillons de tous les points temporels. Les décongeler simultanément à 37 °C pour évaluer les progénies virales. Vortexer puis centrifuger 5 min à 2 500 x g et 4 °C pour former un culot de débris cellulaires.
5. Calculer les titres moyens de chaque construction et de chaque point temporel comme décrit ci-dessus. Tracer les titres en fonction du temps. Comparer les courbes de croissance des vecteurs avec ou sans transgènes insérés, avec différents transgènes, ou avec des transgènes insérés à des positions différentes (voir Figure 1).

Résultats

Figure 1 : Cinétiques de réplication et activité lytique des virus de la rougeole recombinants. (A) Des courbes de croissance en un seul cycle ont été établies après infection de cellules Vero par le virus de la rougeole oncolytique non modifié (MV) ou par un virus de la rougeole exprimant un engageur bispécifique des lymphocytes T (MV-H-mCD3xhCD20), à un IO de 1. Les titres des progénies virales ont été évalués aux temps indiqués suivant l'infection, montrant des cinétiques de réplication virale similaires. Les moyennes et écarts-types de huit échantillons (quatre réplicats techniques pour chacun des deux réplicats biologiques par point temporel) sont représentées. (B) La viabilité cellulaire a été évaluée sur des cellules de carcinome colorectal murin MC38 exprimant de façon stable l'antigène carcino-embryonnaire humain et le récepteur du virus de la rougeole CD46 (MC38-CEA-CD46), après inoculation avec du milieu seul (témoin) ou avec les virus indiqués à un IO de 1. Un test de viabilité cellulaire XTT a été réalisé aux temps indiqués. Une diminution de la viabilité cellulaire a été observée plus précocement avec le vecteur non modifié. Des valeurs supérieures à 100 %, telles que calculées pour MV-H-mCD3xhCD20 au temps de 12 h, sont fréquemment observées peu après l'infection, ce qui pourrait être dû à un stress cellulaire ou à des facteurs d'origine cellulaire présents dans la suspension virale. Les valeurs moyennes plus les écarts-types de trois réplicats techniques sont indiquées pour chaque point temporel.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu de base modifié de Dulbecco (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Allemagne	31966-021	Utilisé pour la mise en culture et l'infection des cellules Vero
Sérum de veau fœtal (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500	Pour la supplémentation du DMEM
Cellules Vero	ATCC, Manassas, VA, États-Unis	CCL81	Cellules hôtes pour la propagation et les tests du virus de la rougeole
Plaques 12-puits	Neolab, Heidelberg, Allemagne	353043	Pour la mise en culture des cellules Vero (1 × 10⁵ par puits)
Opti-MEM (milieu sans sérum)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Allemagne	31985070	Pour l'étape d'infection virale (incubation sans sérum)
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Allemagne	14190-094	Pour le lavage et la préparation du milieu
Détacheur cellulaire	Corning, Reynosa, Mexique	3008	Utilisé pour racler les cellules infectées lors de la récolte
Tubes de 50 mL	nerbe plus, Winsen/Luhe, Allemagne	02-572-3001	Pour la collecte des échantillons et la centrifugation
Azote liquide	—	—	Pour la congélation rapide des échantillons viraux récoltés
Centrifugeuse (capable de 2 500 × g)	—	—	Pour la formation du culot des débris cellulaires
Kit de viabilité cellulaire XTT (Kit colorimétrique de viabilité cellulaire III)	PromoKine, Heidelberg, Allemagne	PK-CA20-300-1000	Contient le réactif XTT ; pour la mesure de la cytotoxicité
Plaques 96-puits, fond plat	Neolab, Heidelberg, Allemagne	353072	Pour la mesure de l'absorbance à 450 nm
Spectrophotomètre / Lecteur de microplaques	—	—	Pour mesurer l'absorbance optique à 450 nm (référence 630 nm)
Incubateur au dioxyde de carbone	—	—	37 °C, 5 % CO₂ pour toutes les incubations cellulaires