Évaluation de l'activité immunomodulatrice d'un engageur de cellules T bispécifique codé par un virus

Résumé

Source : Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxovirus pour l'immunomodulation ciblée des tumeurs : conception et évaluation ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Ce vidéo montre un test cellulaire permettant d'évaluer l'activité immunomodulatrice spécifique à la cible d'un engageur bispécifique de lymphocytes T (BTE) codé par un virus. Le BTE relie les cellules tumorales exprimant un récepteur cible aux lymphocytes T, déclenchant la lyse tumorale et la libération d'enzymes. Une détection colorimétrique, fondée sur la conversion d'un substrat, indique l'activation des lymphocytes T. Une intensité de couleur plus élevée dans l'échantillon test confirme l'engagement immunitaire, médié par le BTE et spécifique au récepteur.

Protocole

1. Évaluer la fonctionnalité immunologique des immunomodulateurs isolés.
   1. La description suivante détaille la manière d'évaluer la cytotoxicité induite par un activateur bispécifique de lymphocytes T (BTE) et médiée par les cellules, au moyen d'un dosage de la libération de lactate déshydrogénase (LDH).
      1. Définir les conditions à tester durant l'expérience (voir Figure 1 comme exemple). Les points temporels (heures à jours), les concentrations de l'immunomodulateur (pg/mL à µg/mL) et les rapports effecteurs sur cellules cibles (E:T) (par exemple entre 1:50 et 50:1) peuvent être modulés. Préparer systématiquement les échantillons en triplicata.
      2. Inclure des échantillons sans protéine BTE et sans cellules effectrices, des contrôles de libération spontanée de LDH pour chaque type cellulaire isolé (Tsp et Esp), un contrôle de lyse maximale des cellules cibles (Tmax) avec ajout de détergent avant la lecture, un contrôle contenant uniquement le milieu, ainsi qu'un contrôle de volume pour Tmax.
         REMARQUE : Le nombre requis de cellules cibles et les durées d'incubation peuvent varier. Réaliser des essais préliminaires sans cellules effectrices ni immunomodulateurs afin d'identifier les paramètres optimaux. Inclure les échantillons Tsp et Tmax ainsi que les contrôles correspondants pour évaluer différents nombres cellulaires et points temporels.
      3. Isoler les cellules effectrices immunitaires (par exemple par centrifugation en gradient de densité du sang humain pour obtenir des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ou par sélection négative de lymphocytes T murins à partir de splénocytes de souris).
      4. Ensemencer les cellules cibles (par exemple 5 x 10³ par puits) dans une plaque 96 puits à fond rond.
      5. Ajouter la protéine isolée aux concentrations souhaitées aux échantillons respectifs. Ajouter les cellules effectrices immunitaires aux rapports souhaités. Ajouter du milieu jusqu'à un volume total de 100 µL par puits.
      6. Incuber pendant la durée déterminée, généralement entre 4 et 48 h (24 h pour des PBMC non stimulés et 48 h pour des lymphocytes T murins fraîchement isolés ; des durées d'incubation plus courtes peuvent s'appliquer pour des cellules immunitaires préstimulées), à 37 °C et 5 % CO₂.
      7. 45 minutes avant la collecte des échantillons, ajouter 10 µL de solution de lyse 10x dans les puits contenant les échantillons Tmax et les contrôles de milieu correspondants. Poursuivre l'incubation.
      8. Centrifuger les cellules à 250 x g pendant 4 min. Transférer 50 µL de chaque surnageant dans une plaque 96 puits à fond plat. Ne pas transférer les cellules afin d'éviter la LDH liée aux cellules.
      9. Préparer la solution substrat conformément aux instructions du fabricant. Ajouter 50 µL dans chaque puits et incuber à température ambiante [RT] à l'abri de la lumière pendant 30 min ou jusqu'à ce que les échantillons Tmax deviennent rouge foncé.
      10. Ajouter 50 µL de solution d'arrêt à chaque puits. Éliminer les bulles d'air par centrifugation pendant 1 min à 4 000 x g, puis manuellement à l'aide d'une aiguille creuse. Mesurer l'absorbance optique à 490 nm.
      11. Calculer les valeurs de lyse spécifique en pourcentage pour chaque échantillon.
          1. Calculer les moyennes des réplicats des contrôles de milieu avec et sans solution de lyse. Soustraire les valeurs obtenues des échantillons expérimentaux ainsi que des contrôles Tmax et de libération spontanée, respectivement. Utiliser ces valeurs corrigées du fond pour les calculs ultérieurs.
          2. Calculer les moyennes des contrôles Tmax, Tsp et Esp corrigés du fond. À l'aide de ces valeurs moyennes, l'équation suivante fournit le pourcentage de lyse spécifique pour chaque échantillon :
             
          3. Tracer les valeurs de lyse spécifique en pourcentage en fonction de la concentration en protéine ou du rapport E:T, et comparer aux échantillons de contrôle non ciblants.

Résultats

Figure 1 : Activité cytotoxique des BTE codés par le virus de la rougeole. Des cellules tumorales cibles (5 x 10³ cellules B16-CD20-CD46 par puits) ont été incubées avec des lymphocytes T murins à un ratio de 1:50. Les BTE (activateurs bispécifiques de lymphocytes T) préalablement purifiés à partir du surnageant de cellules infectées par MV (virus de la rougeole)-H-mCD3xhCD20 ont été ajoutés aux concentrations indiquées. La lyse relative des cellules cibles a été évaluée par dosage de la libération de LDH après 48 h. Les cellules dépourvues de l’antigène cible du BTE (B16-CD46) ont servi de référence pour évaluer la cytotoxicité spécifique de l’antigène. Les moyennes plus écarts-types de trois réplicats techniques par échantillon sont représentées. Les cellules exprimant l’antigène cible ont été spécifiquement lysées de manière dépendante de la concentration en BTE. La pureté du produit BTE et les niveaux d’expression de l’antigène cible influencent la destruction cellulaire. Dans le présent exemple, une destruction cellulaire spécifique de 15 % a été obtenue à une concentration relativement élevée de BTE de 1 µg/mL. Cette valeur est typique d’un tel montage expérimental avec de longues durées de co-incubation et des conditions de culture sous-optimales des lymphocytes T. Dans d’autres conditions, jusqu’à 60 % de destruction spécifique ont été observés avec des BTE purifiés à partir de surnageants de cellules infectées par MV, atteignant un plateau à des concentrations de BTE de 100 ng/mL et plus. Cela indique, de manière contre-intuitive, que la limite de cet essai est inférieure à 100 % de destruction spécifique, ce qui peut s’expliquer par des cinétiques de croissance différentes entre les témoins Tmax et les échantillons en co-culture.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM (milieu de Dulbecco modifié par Eagle)	Invitrogen, Darmstadt, Allemagne	31966-021
Sérum de veau fœtal (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500
Kanamycine	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne	K0129
B16-CD46 / B16-CD20-CD46	J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg		disponible sur demande
Kit colorimétrique de viabilité cellulaire III (XTT)	PromoKine, Heidelberg, Allemagne	PK-CA20-300-1000	inclut le réactif XTT
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Allemagne	14190-094
Colonnes de centrifugation QIAquick Ni-NTA	QIAGEN, Hilden, Allemagne	31014
Plaques 96 puits, fond rond	TPP, Trasadingen, Suisse	92097
Plaques 96 puits, fond plat	Neolab, Heidelberg, Allemagne	353072