Recouvrement de virions infectieux à partir de cellules transfectées avec de l'ARN synthétique dérivé d'un chromosome artificiel bactérien

Résumé

Source : Yun, S. et al. Chromosomes artificiels bactériens : un outil de génomique fonctionnelle pour l'étude des virus à ARN simple brin positif. J. Vis. Exp. (2015)

Ce vidéo montre la récupération du virus de l'encéphalite japonaise infectieux à partir d'ARN synthétique transcrit à partir d'un clone de chromosome artificiel bactérien. Elle illustre comment les cellules sont électroporées avec l'ARN synthétique, permettant au génome viral de diriger la production de nouvelles particules virales. Les plaques résultantes formées dans les monocouches cellulaires infectées confirment la récupération réussie du virus infectieux.

Protocole

1. Déterminer l'infectiosité de l'ARN et le rendement viral

1. Cultiver des cellules de rein de hamster de bébé-21 (BHK-21) dans des boîtes de culture de 150 mm à une densité de 3 × 10⁶ cellules/boîte pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   REMARQUE : Maintenir les cellules BHK-21 dans un milieu minimum essentiel alpha complété avec 10 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de glutamine, des vitamines et de la pénicilline/streptomycine.
2. Rincer la monocouche cellulaire avec 10 ml de Solution A froide (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄ et 1,5 mM KH₂PO₄). Détacher les cellules des boîtes par traitement avec 4 ml de trypsine-acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) (0,25 %) et les recueillir par centrifugation à 270 × g dans une centrifugeuse de table pendant 2 min.
3. Resuspendre le culot cellulaire avec 50 ml de Solution A froide dans un tube conique de 50 ml et centrifuger la suspension cellulaire à 270 × g pendant 2 min. Répéter cette procédure de lavage trois fois ; après le dernier lavage, resuspendre le culot cellulaire à une densité de 2 × 10⁷ cellules/ml dans la Solution A.
4. Mélanger un aliquot de 400 µl de suspension cellulaire avec 2 µg d'ARN synthétique dans une cuvette à entrefer de 2 mm et électroporer rapidement le mélange à l’aide d’un électroporateur dans des conditions optimales d’électroporation : 980 V, durée d’impulsion de 99 µs et 5 impulsions (Figure 1C).
5. Laisser les cellules électroporées à température ambiante (TA) pendant 10 min, puis les transférer dans un microtube de 1,7 ml contenant 600 µl de milieu de culture complet.
6. Préparer une dilution sérielle décimale des cellules électroporées dans 1 ml de milieu de culture complet et déposer un aliquot de 100 µl de chaque dilution sur les monocouches de cellules BHK-21 non électroporées (5 × 10⁵) dans une plaque à 6 puits.
7. Après 4 à 6 h d’incubation, recouvrir les cellules avec 0,5 % d’agarose dans un milieu minimum essentiel contenant 10 % de sérum de veau fœtal. Incuber les plaques pendant 4 jours à 37 °C avec 5 % de CO₂.
8. Visualiser les centres infectieux (plaques) par fixation avec du formaldéhyde à 7 % et coloration avec du violet de crésyl à 1 % dans 5 % d’éthanol (Figure 2A).
   1. Facultatif : Examiner les cellules électroporées avec l’ARN 18 à 20 h après la transfection pour l’expression des protéines du virus de l’encéphalite japonaise (JEV) par des tests d’immunofluorescence (Figure 2B), et recueillir les surnageants des cellules électroporées avec l’ARN à 22 et 40 h après la transfection pour la titration du virus par des tests de plaques (Figure 2C).

Résultats

Figure 1. Aperçu de la récupération de virus infectieux à partir d'un ADN complémentaire (ADNc) complet de JEV SA₁₄-14-2 assemblé dans un chromosome artificiel bactérien (BAC). (A) Linéarisation du modèle d'ADNc. Le BAC complet de JEV est coupé par XbaI et traité avec la nucléase de haricot mungo (MBN). (B) Synthèse des transcrits d'ARN. L'ADNc linéarisé est transcrit par la polymérase SP6 ARN en présence d'un analogue de capuchon m⁷G(5')ppp(5')A. (C) Récupération des virus synthétiques de JEV. Les ARN transcrits in vitro sont transférés dans des cellules BHK-21 par électroporation, ce qui génère un titre élevé de virus synthétique.

Figure 2. Infectivité spécifique des ARN synthétiques transcrits à partir d'un ADNc complet de JEV et récupération du virus synthétique. Des cellules BHK-21 sont électroporées de manière factice (Mock) ou électroporées avec des transcrits d'ARN provenant de chacun des deux clones indépendants de l'ADNc complet de JEV (Cl.1 et Cl.2). (A) Infectivité de l'ARN. Les cellules sont recouvertes d'agarose et colorées au violet de crésyl 4 jours après la transfection. L'infectivité de l'ARN est déterminée par des tests de centres infectieux afin d'estimer la quantité d'ARN infectieux électroporée dans les cellules (panneau gauche). Des images représentatives des centres infectieux sont également présentées (panneau droit). (B) Expression protéique. Les cellules sont cultivées dans des chambres à 4 puits. L'expression des protéines virales dans les cellules électroporées avec l'ARN 20 heures après la transfection (hpt) est analysée par des tests d'immunofluorescence en utilisant un anticorps primaire de lapin anti-protéine non structurale 1 (NS1) et un anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de lapin conjugué au Cy3 (rouge). Les noyaux sont contre-colorés au 4',6-diamidino-2-phénylindole (bleu). Les images d'immunofluorescence sont superposées aux images correspondantes de contraste interférentiel différentiel. (C) Rendement viral. Les cellules sont cultivées dans des boîtes de culture de 150 mm. La production de particules virales infectieuses accumulées dans les surnageants de culture des cellules électroporées avec l'ARN à 22 et 40 heures après la transfection (hpt) est évaluée par des tests de plaques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu minimum essentiel alpha	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Agarose	Lonza	50004
Tube conique (50 mL)	VWR	21008-242
Violet de crésyl	Sigma-Aldrich	C0775
Boîte de culture (150 mm)	TPP	93150
Cuvette (écartement de 2 mm)	Harvard Apparatus	450125
Sérum de veau fœtal	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldéhyde	Sigma-Aldrich	F1635	Toxique et cancérigène
Glutamine	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Milieu minimum essentiel	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Pénicilline/Streptomycine	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P3911
Phosphate monobasique de potassium	Sigma-Aldrich	P9791
Plaque à six puits	TPP	92006
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S3014
Phosphate dibasique de sodium	Sigma-Aldrich	S3264
Trypsine-EDTA (0,25 %)	Life Technologies (Gibco)	25200-056
Vitamines	Sigma-Aldrich	M6895
Incubateur CO₂	Thermo Scientific	Heracell 150i
Centrifugeuse de table	Thermo Scientific	ST16R
Électroporateur	Harvard Apparatus	ECM 830