Article de méthode

Finger-stick Méthode d'échantillonnage de sang pour la détermination des induite par l'exercice apoptose des lymphocytes

DOI :

10.3791/2595

⸱

24 février 2011

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1Department of Kinesiology, Recreation, and Sport, Western Kentucky University, 2Department of Health and Human Performance, University of Houston

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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L'exercice est capable d'induire l'apoptose dans les cellules immunitaires. Il ya des limites de mesure différents, notamment relatives à la quantité de temps requise pour isoler et traiter un échantillon de sang avant l'évaluation. Démontrée est une procédure rapide et peu invasive pour l'analyse de l'exercice apoptose induite par des lymphocytes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'exercice est un stimulus physiologique capable d'induire l'apoptose dans les cellules immunitaires. À ce jour, diverses limitations ont été identifiées à la mesure de ce phénomène, notamment relatives à la quantité de temps requise pour isoler et traiter un échantillon de sang avant l'évaluation de la mort cellulaire. Pour cette raison, il est difficile de déterminer si les augmentations signalées dans l'apoptose des cellules immunitaires peut être contribué à l'effet réel de l'exercice sur le système, ou sont un reflet de l'époque et le traitement nécessaire pour obtenir finalement cette mesure. Dans cet article, nous démontrons une procédure rapide et peu invasive pour l'analyse de l'exercice apoptose induite par des lymphocytes. Contrairement à d'autres techniques, le sang total est ajouté à un panel d'anticorps immédiatement après l'obtention d'un échantillon. Après la période d'incubation, les globules rouges sont lysés et les échantillons sont prêts à être analysés. L'utilisation d'une procédure d'échantillonnage doigt bâton réduit le volume de sang nécessaire, et minimise l'inconfort pour les sujets.

Protocole

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1. Prélèvement de sang Finger-Stick

  1. Collecte de sang total est généralement pris au repos pour une mesure de référence (généralement après 10 à 15 min de repos assis), pendant ou immédiatement après une séance d'exercice, et tout au long de la période post-exercice (généralement de 1-3 heures suivant la cessation de la l'exercice).
  2. Les précautions universelles, d'abord stériliser le bout des doigts avec de l'alcool isopropylique à 70%.
  3. Ensuite, percer le site en utilisant une lancette automatique ou un appareil similaire. Bien que nous utilisions une lancette de calibre 30 pour assurer un confort sujet, une aiguille plus gros calibre pourrait être utilisé.
  4. Essuyer la première goutte de sang, puis de recueillir le sang dans des tubes capillaires ou microvettes traités avec l'héparine de lithium pour empêcher la coagulation.

2. Phénotypage cellulaire et l'apoptose Coloration

  1. Ajouter 10 uL de sang hépariné entier panel d'anticorps titrés dans 250 uL de tampon de liaison (voir tableau 1 schématique). Nous avons utilisé un facteur de dilution 1:20 avec succès, mais chaque laboratoire doit son titre réactifs pour déterminer la meilleure solution de travail.
    Panel d'anticorps tableau 1. Pour la détermination de l'apoptose induite par l'exercice en sous-ensembles de leucocytes. Apoptose précoce a été défini par l'expression de l'annexine V, tandis que l'apoptose tardive a été défini par l'étiquetage positif double avec l'annexine V et 7-AAD. Les cellules nécrotiques ont été annexine V et 7-AAD + cellules seulement.
    Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4
    Seules les cellules du tube Annexine V - FITC Annexine V - FITC Annexine V - FITC
    Anti CD4 humaines - PE Anti CD8 humain - PE Anti humaines CD19 - PE
    7-AAD 7-AAD 7-AAD
    Anti homme CD45RA - APC Anti homme CD45RA - APC

    7-AAD = 7-amino-actinomycine D, APC = allophycocyanine, CD4 = lymphocytes T auxiliaires, lymphocytes CD8 T = suppresseurs / cytotoxiques, lymphocytes B CD19 =, = sous-ensembles de cellules CD45RA naïf, FITC = isothiocyanate de fluorescéine, PE = phycoérythrine.
  2. Incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 30 minutes.
  3. Centrifuger à 1075 xg pendant 5-10 minutes.
  4. Décanter, ajouter 300 ul de tampon de lyse des globules, et de manière approfondie vortex.
  5. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
  6. Ajouter 300 ul de PBS pour arrêter la réaction lyse RBC.
  7. Centrifuger à 1075 xg pendant 5-10 minutes.
  8. Décanter, rack, et ajouter 50 ul de tampon contraignant.
  9. Analyser par cytométrie en flux.

Il est recommandé au minimum, les contrôles suivants seront utilisés: un tube de cellules uniquement pour servir de contrôle négatif dans la détection de l'autofluorescence de fond, et des tubes contenant chacun fluorochrome pour fixer la rémunération lors de la configuration initiale du cytomètre de flux. De plus, nous avons utilisé des perles standards de compensation mis en place avec succès pour nos expériences.

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Discussion

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Un exemple de procédure minimalement invasive collecte et l'analyse subséquente est démontrée pour l'analyse des phases précoces et tardives de l'exercice apoptose induite par des lymphocytes. Il est également possible d'exclure clairement de ces cellules, qui sont nécrosées, et non apoptotiques. Cette procédure permet de surmonter les inconvénients et l'inconfort associés à la ponction veineuse invasif de la région du coude à plusieurs moments, avant, pendant et immédiatement après l'exercice, o...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Cette recherche a été soutenu par une subvention aux nouveaux professeurs de la Faculté au Conseil des bourses Western Kentucky University.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tampon de liaison pour cytométrie en fluxeBioscience00-4222-26
Tampon de lyse des globules rougeseBioscience00-4333-57
Dispositif lanceurAccu Check Soft TouchRoche Group
Tubes capillairesTubes capillaires héparinésChase Scientific Glass, Inc.501
CentrifugeuseGmC LabGilson, Inc.PMS-880
Annexine V-FITC conjuguéeBiovision Inc.K201-400-1
CD4-PE conjuguéAnti-humain, clone RPA-T4eBioscience12-0049-42
CD8-PE conjuguéAnti-humain, clone OKT8eBioscience12-0086-73
CD19-PE conjuguéAnti-humain, clone HIB19eBioscience12-0199-42
Solution de coloration de viabilité 7-AADeBioscience00-6993-50
CD45RA-APC conjuguéAnti-humain, clone HI100eBioscience17-0458-42
Cytomètre en fluxC6Accuri

Références

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  1. Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
  2. Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
  3. Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
  4. Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
  5. Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
  6. Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
  7. Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).

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Mots-clés

Cytom trie en fluxlyse des globules rougesmarquage l annexine Vapoptose induite par l exerciceanalyse du sang totalsous fractions lymphocytairespr l vement par tube capillaireincubation du panel d anticorps

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