Mise à jour annexine V / propidium Assay apoptose iodure permettant une évaluation précise de la mort cellulaire

Cette procédure peut être effectuée dans 500 ul des tubes siliconés ou 6 ml en polystyrène à fond rond tubes FACS. Ce dernier est normalement utilisée lors de la réalisation d'analyses de viabilité en conjonction avec d'autres procédures. Tous les volumes sont donnés à 6 ml tubes en polystyrène FACS à fond rond. Pour 500 ul des tubes siliconés, de réduire l'ensemble des volumes de 1 / 5.

La concentration optimale pour l'analyse de cytométrie en flux est de 2-4 x 10 ⁶ cellules par 200 le volume ul. La perte de cellules peuvent résulter de cette procédure et donc nous recommandons que chaque échantillon se compose de 4 x 10 ⁶ cellules au début de la procédure.

1. Préparation des cellules

1. Récolte des cellules - se référer à des procédures spécifiques pour les lignées de cellules correspondant ou des isolations de cellules primaires.
2. Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant.
3. Resuspendre les cellules dans 2 ml de phosphate 1 x saline tamponnée (PBS) ^{- / -} (pas de calcium, de magnésium aucune).
4. Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant.
5. Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon 1 x V annexine contraignant.
6. Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant.
7. Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon 1 x V annexine contraignant.

2. Application de l'annexine V / PI Stain

1. Ajouter annexine V, conformément aux recommandations du fabricant [par exemple, 5 uL annexine V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].
2. Incuber les tubes dans l'obscurité pendant 15 minutes à température ambiante.
3. Ajouter 100 ul d'une mémoire tampon annexine V x contraignant pour chaque tube de réaction. Il devrait y avoir environ 200 uL dans chaque tube.
4. Ajouter 4 pi de PI (Sigma, Cat # P-4864-10 ml) qui a été diluée à 1:10 dans une mémoire tampon annexine V x contraignant (1 PI uL avec 9 x 1 ul annexine V tampon de liaison). Cela produira une concentration finale de PI 2 ug / ml dans chaque échantillon.
5. Incuber les tubes dans l'obscurité pendant 15 minutes à température ambiante.
6. Ajouter 500 ul 1 x annexine V tampon de liaison pour laver les cellules.
7. Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant.
8. Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon 1 x V annexine contraignant et 500 uL de formaldéhyde à 2% pour créer une solution à 1% de formaldéhyde (fixateur). Mélanger en tapotant doucement les tubes.
9. Fixer les échantillons sur la glace pendant 10 minutes. Alternativement, les échantillons peuvent être conservés une nuit à 4 ° C dans l'obscurité. Si cette dernière méthode est choisie, assurez-vous d'être cohérent dans tous les tubes étiquetés avec l'annexine V / PI (y compris les contrôles de compensation).
10. Ajouter 1 mL 1 x PBS ^{- / -} pour chaque échantillon et mélanger doucement en tapotant.
11. Centrifuger les tubes à 425 x g pendant huit minutes et décanter le surnageant.
12. Répétez les étapes 2.10 et 2.11.
13. Resuspendre le culot en feuilletant le tube.
14. Ajouter 16 uL d'dilué à 1:100 Une RNase (Sigma, R4642) pour donner une concentration finale de 50 ug / ml. Incuber pendant 15 min à 37 ° C.
15. Ajouter 1 mL 1 x PBS ^{- / -} et mélanger doucement en tapotant.
16. Centrifuger les tubes à 425 x g pendant huit minutes.
17. Les échantillons sont maintenant prêts à être analysés. Alternativement, les échantillons peuvent être utilisés pour les étapes ultérieures, si coloration annexine / PI coloration est effectuée en parallèle avec d'autres procédures.

3. Les résultats représentatifs:

Exemples de types de cellules et de lignées cellulaires qui présentent divers degrés de coloration PI faux-positifs sont présentés dans la figure 1. Pour tenir compte des événements de faux-positifs, les cellules ont été fixées puis traités à la RNase A. Il en résulte une diminution significative du nombre de faux positifs événements, comparativement aux cellules qui n'ont pas subi un traitement RNase (figure 2B). La figure 2C montre des images représentant des cellules qui ont subi un traitement RNase, par rapport aux cellules qui n'ont reçu aucun traitement RNase. La figure 3 montre comment la modification annexine V / PI protocole, avec fixation et étapes de traitement RNase, améliore les protocoles conventionnels en limitant le nombre d'événements coloration de faux-positifs.

Figure 1. Conventionnel protocoles iodure de propidium coloration conduire à un nombre important de faux événements positifs. Nous avons déjà évalué l'étendue de la coloration de faux positifs dans les cellules primaires à travers un large éventail de modèles animaux ainsi que dans une variété de ¹⁰ lignées cellulaires. Images représentant montrent l'étendue de coloration de faux positifs dans les trois populations cellulaires uniques (une lignée cellulaire couramment utilisés - les macrophages RAW et deux cellules primaires - les macrophages murins de moelle osseuse (BMM) et les macrophages des poissons rouges rénale primaire (PKM)). Certes les événements positifs attendus afficher le co-localisation entre PI et DRAQ5 dans le compartiment nucléaire (zones jaunes représentent colocalisation entre PI et DRAQ5). DRAQ5 est très membraNE perméables colorant qui précise compartiment colorants nucléaires dans les deux cellules vivantes et mortes ^10,11,12. Pour faciliter la détermination visuelle de la colocalisation DRAQ5 tache a été donnée une pseudo couleurs vertes.

Figure 2. Améliorer la précision du PI coloration nucléaire. (A) Nous avons évalué la précision de la PI coloration nucléaire basée sur le degré de similitude d'un certain nombre de taches bien caractérisés nucléaire (BrdU, 7-AAD et DAPI) pour DRAQ5. BrdU est un nucléoside synthétique qui est incorporé dans l'ADN des cellules en prolifération, et en tant que tels ne tache dans le compartiment nucléaire. 7-AAD a une forte affinité pour l'ADN et, semblable à PI, ne peut pas traverser une membrane plasmique intacte. DAPI a également une forte affinité pour l'ADN et le nucléaire, le plus couramment utilisé dans la coloration de microscopie à fluorescence. Le degré de similarité était> 99% entre BrdU, 7-AAD, DAPI et DRAQ5, mettant en évidence leur capacité à bien tacher le noyau de la cellule en RAW 264.7 macrophages. En revanche, coloration cytoplasmique PI repose sur des protocoles classiques conduit à une diminution marquée de la similitude pour cent de coloration par rapport à DRAQ5. (B) Des résultats similaires sont observés dans deux cellules primaires testées: les macrophages murins de moelle osseuse (BMM) et les macrophages des poissons rouges rénale primaire (PKM). Incorporation de 50 ug / ml de RNase A au stade spécifique au sein de la procédure de coloration supprime coloration PI non nucléaire et augmente considérablement le degré de similitude par rapport à DRAQ5 coloration. (C) des images représentant des macrophages rénaux primaires montrent le degré de similitude des cellules avec et sans traitement RNase. Pour faciliter la détermination visuelle des différences entre les traitements, DRAQ5 a été donné un vert. Les zones jaunes représentent colocalisation entre BrdU et DRAQ5 et PI et DRAQ5.

Figure 3. Mise à jour annexine V / PI réduit significativement l'apoptose fausses / événements nécrotiques. Primaire des macrophages rénaux Goldfish (PKM) ont été colorés avec conventionnels et modifiés annexine V / PI protocoles. Les diagrammes de dispersion illustrent l'annexine V / PI tache dans PKM poissons rouges. Le nuage de points sur la gauche montre conventionnelle annexine V / PI coloration (pas de RNase) des cellules PKM. Le nuage de points sur la droite montre les cellules PKM colorés avec le V modifiés annexine / PI protocole (par la RNase). L'addition de RNase en une réduction marquée de la coloration PI en raison de la suppression des fausses taches de positif. PKM cellules ont ensuite été analysées en fonction des populations distinctes dans les progéniteurs des cultures-précoce (EP), les monocytes (Mono) et les macrophages matures (Mat Mac). La réduction du nombre d'événements positifs PI, en raison de l'enlèvement de faux événements positifs est plus prononcé dans les grandes cellules macrophages matures que dans les petites cellules souches précoces. Les conclusions fondées sur des protocoles classiques aurait tort suggéré une corrélation positive dans la mort cellulaire des sous-ensembles de macrophages plus mature.