Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

Résumé

Une méthode efficace pour obtenir des fractions hautement purifiées viables méiotiques de la souris testicule est décrit, qui combine un cadre raffiné dissociation cellulaire protocole avec le tri de cellules fluorescentes (FACS). Cette méthode tire parti des différences dans le contenu en ADN et de la densité nucléaire de fractions distinctes méiotique.

Résumé

Le caractère hétérogène de types de cellules dans les testicules et l'absence de modèles de culture cellulaire méiotique ont été des obstacles importants à l'étude de la différenciation des programmes uniques qui se manifestent lors de la méiose. Deux principales méthodes ont été développées pour purifier, à des degrés divers, diverses fractions méiotique à la fois adulte et immature animaux: élutriation ou Staput (sédimentation) à l'aide de BSA et / ou des gradients de Percoll. Ces deux méthodes reposent sur ​​la taille des cellules et la densité de séparer les cellules méiotiques ^1-5. Dans l'ensemble, sauf pour quelques populations de cellules ^6, ces protocoles ne parviennent pas à donner une pureté suffisante des populations de nombreuses cellules méiotiques qui sont nécessaires pour des analyses détaillées moléculaire. Par ailleurs, avec de telles méthodes habituellement un type de cellules méiotiques peut être purifié à un moment donné, ce qui ajoute un niveau supplémentaire de complexité quant à la reproductibilité et l'homogénéité en comparant des échantillons de cellules méiotiques.

Ici, nous décrivons une méthode raffinée qui permet de visualiser facilement, d'identifier et de purifier les cellules méiotiques, à partir des cellules germinales afin de spermatides rondes, en utilisant FACS combiné avec Hoechst 33342 coloration ^7,8. Cette méthode fournit un instantané global de l'ensemble du processus méiotique et permet de purifier les cellules viables hautement de la plupart des étapes de la méiose. Ces cellules purifiées peuvent alors être analysés en détail pour des changements moléculaires qui accompagnent la progression à travers la méiose, par exemple des changements dans les ^9,10 expression des gènes et la dynamique de l'occupation des nucléosomes sur les hotspots de la recombinaison méiotique ^11.

Protocole

Ce protocole peut être séparé en deux grandes étapes: (1) la dissociation et Hoechst 33342 coloration des cellules des testicules de souris suivie, si nécessaire, (2) FACS de tri des fractions pertinentes méiotique, y compris toutes les étapes de la méiose, à partir de cellules germinales au spermatides rondes. Une fois collectées, ces populations hautement enrichi méiotique peut être utilisé pour un large éventail d'analyses. Ce protocole décrit la dissociation d'un testicule adulte; volumes peuvent être adaptées en conséquence pour les mineurs ou pour les testicules supplémentaires.

1. Testicule dissociation

1. Placez un testicu....

Discussion

Le protocole présenté ici permet un à la fois purifier de souris mâles adultes toute la gamme des cellules stade de la méiose avec une très grande pureté, ce qui permet aux enquêteurs d'étudier la dynamique de ce processus fondamental. Cellules purifiées peuvent être utilisées pour de nombreuses applications allant de l'extraction de l'ARN ^9,10, la cartographie nucléosome ^11, la détection de molécules recombinantes, les analyses de protéines, et beaucoup plus. Cependant, les méthodes de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagénase de type 1	Worthington Biochemical	CLSS1	Dissoudre à 12 000 U/ml dans du GBSS, conserver à 4°C
Tripsine	Worthington Biochemical	TRL3	Dissoudre dans du HCl 1 mM à 50 mg/ml, conserver à 4°C
H–chst 33342	Acros Organics	230001000	Solution saturée (10 mg/ml dans du DMSO), conserver à 4°C
DNase I	Sigma-Aldrich	DNEP	Dissoudre dans de l’eau/glycérol 50 % à 1 mg/ml, conserver à -20°C
Solution saline équilibrée de Gey’s	Sigma-Aldrich	G9779
Pipette de transfert de 6"	Fisher Scientific	137119D