Une méthode efficace pour évaluer l'exposition en surface des protéines de leptospires est décrite. La méthode est spécifiquement conçue pour éviter toute perturbation de la membrane externe des cellules fragiles de leptospires. Cette technique nécessite l'emploi de plusieurs contrôles négatifs pour évaluer l'intégrité de la membrane externe et la spécificité de la réaction d'anticorps.
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Article de méthode
Immuno-fluorescence Dosage des leptospires exposées à la surface Protéines
Dans cet article
Résumé
Résumé
Protéines de surface bactériennes sont impliqués dans le contact direct avec les cellules hôtes et de l'absorption des nutriments provenant de l'environnement 1. Pour cette raison, la localisation cellulaire peut fournir des indications sur le rôle fonctionnel des protéines bactériennes. Localisation à la surface des protéines bactériennes est une étape clé vers l'identification des facteurs de virulence impliqués dans les mécanismes de pathogénicité.
Méthodes de fractionnement de leptospires 2-5 membranes peuvent être sélectif pour une certaine classe de protéines de la membrane externe (OMP), telles que les lipoprotéines vs OMP transmembranaire, et donc conduire à une classification erronée. C'est probablement ce qui est dû à des différences structurelles et comment elles sont associées à la membrane externe. Les lipoprotéines sont associés aux membranes par une interaction hydrophobe entre le fragment N-terminal de lipides (trois acides gras) et les phospholipides bicouche lipidique 6, 7. En revanche, les OMP transmembranaires sont généralement intégrés dans la bicouche lipidique par amphipathiques β-feuilles disposées dans une structure en tonneau, comme 8, 9. En outre, la présence d'une protéine dans la membrane externe, ne garantit pas nécessairement que la protéine ou ses domaines sont exposés à la surface. Spirochetal membranes externes sont connus pour être des méthodes fragile et nécessite donc impliquant une manipulation douce des cellules et l'inclusion de sous-surface de la protéine de contrôle pour évaluer l'intégrité de la membrane externe.
Ici, nous présentons une technique d'immunofluorescence (IFA) méthode pour évaluer directement l'exposition sur la surface des protéines intactes leptospires. Cette méthode est basée sur la reconnaissance des protéines de surface de leptospires par l'antigène-anticorps spécifiques. Ici, des anticorps spécifiques pour OmpL54 10 sont detetcted aftero se liant à des épitopes natifs de surface, exposée. Comparaison de la réactivité des anticorps aux cellules intactes par rapport perméabilisées permet d'évaluer la distribution cellulaire et si oui ou non une protéine est sélectivement présents sur la surface de leptospires. L'intégrité de la membrane externe devrait être évaluée à l'aide d'anticorps à un ou plusieurs protéines de subsurface, situé de préférence dans le périplasme.
La méthode de la surface IFA peut être utilisé pour analyser l'exposition en surface d'une protéine de leptospires à laquelle les anticorps spécifiques sont disponibles. Tant l'utilité et la limitation de la méthode dépend de savoir si les anticorps utilisés sont capables de se lier à des épitopes natifs. Puisque les anticorps sont souvent soulevés contre les protéines recombinantes, les épitopes des indigènes, exposées à la surface des protéines peuvent ne pas être reconnu. Néanmoins, la méthode de la surface IFA est un outil précieux pour l'étude des composantes de la surface intacte bactérienne. Cette méthode peut être appliquée non seulement pour les leptospires, mais aussi d'autres spirochètes et les bactéries gram-négatives. Pour plus fortes conclusions concernant surface d'exposition de OMP, une approche globale impliquant plusieurs méthodes de localisation cellulaire est recommandé 10.
Protocole
1. Fixation des lames de verre Leptospira
- Leptospira interrogans est une classe BSL2 pathogène. Travailler avec des cellules vivantes elle nécessite la manipulation appropriées, telles que porter des gants, sarrau et les étapes de pipetage dans une hotte stérile.
- Cultivez Leptospira dans EMJH medium11, supplémentés avec du sérum de lapin 1% à 30 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent la mi-à fin phase logarithmique (densité de 5 x 10 7 à 5 x 10 8 cellules / ml) pendant environ 6 jours.
- Récolte de la culture par centrifugation à 2000 xg ~ pendant 7 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant par a....
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Discussion
Notre surface IFA technique est similaire à celui utilisé pour démontrer l'exposition de surface de différentes borrelial 15, 16 et 12 de leptospires, 17 protéines. Les détails de la méthode de la surface IFA décrits ici sont conçus pour minimiser la manipulation de cellules dans un effort pour maintenir l'intégrité de la membrane externe, tout en profitant de la tendance des cellules Leptospira d'adhérer à des lames de verre. La méthode consiste à une concentration plus faib.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Cette étude a été soutenue par Public Health Service subventions AI-34431 (pour DAH) de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses et par VA Fonds de recherche médicale (à la DAH).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| Deux lames de verre et de chambre | Lab-Tek | 177380 | |
| Sérum de lapin | Immunochemicals Rockland | D209-00-0100 | |
| Leptospira enrichissement EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (H + L) | Invitrogen / Molecular Probes | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG (H + L) | Invitrogen / Molecular Probes | A-11029 | |
| 4'6-diamidino-2-phényl-indole dichlorhydrate (DAPI) | Invitrogen / Molecular Probes | D1306 | |
| Prolonger d'or anti-fade milieu de montage | Invitrogen / Molecular Probes | P36930 | S'équilibrer à température ambiante avant utilisation |
| Fisherfinest verre Couvercle premium | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope à fluorescence | Zeiss | Axioskop 40 |
Références
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. In....
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