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Article de méthode

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo des cellules souches hématopoïétiques humaines

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DOI :

10.3791/2813

⸱

16 juillet 2011

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

Dans cet article

Résumé

Une Ex vivo Protocole de générer maturité des globules rouges humains à partir souches hématopoïétiques / progéniteurs est décrite. De plus, nous décrivons un système efficace de prestation de lentiviraux méthode pour knockdown l'TAL1 facteur de transcription dans les cellules érythroïdes primaires. L'efficacité de la livraison de gènes médiée lentivirus est démontré en utilisant des virus GFP exprimer.

Résumé

L'érythropoïèse est un système modèle couramment utilisé pour étudier la différenciation cellulaire. Pendant l'érythropoïèse, pluripotentes humain adulte des cellules souches hématopoïétiques (CSH) se différencient en progéniteurs oligopotent, précurseurs engagés et des globules rouges matures 1. Ce processus est régi en grande partie au niveau de l'expression des gènes, par lequel les facteurs de transcription spécifiques d'activer des gènes spécifiques de lignée tout en réprimant de façon concomitante des gènes qui sont spécifiques à d'autres types cellulaires 2. Les études sur les facteurs de transcription réglementant l'érythropoïèse sont souvent réalisées en utilisant des lignées cellulaires humaines et murines qui représentent, dans une certaine mesure, les cellules érythroïdes à des stades donnés de différenciation 3-5. Cependant lignées cellulaires transformées ne peut que partiellement imitent les cellules érythroïdes et surtout ils ne permettent pas d'étudier les changements de manière compréhensible dynamiques qui se produisent que les progrès des cellules par de nombreuses étapes vers leur destin final érythroïdes. Par conséquent, un défi actuel reste le développement d'un protocole d'obtenir une population relativement homogène de CSH primaires et les cellules érythroïdes à différents stades de la différenciation dans des quantités qui sont suffisantes pour effectuer la génomique et la protéomique expériences.

Nous décrivons ici un protocole ex vivo de cellules de culture pour induire la différenciation érythroïde des humains hématopoïétiques cellules souches / progénitrices qui ont été isolées du sang de cordon soit, la moelle osseuse ou du sang périphérique adulte mobilisé par G-CSF (cytaphérèses). Ce système de culture, initialement développé par le laboratoire Douay 6, utilise les cytokines et de co-culture de cellules mésenchymateuses d'imiter le microenvironnement médullaire. En utilisant ce protocole ex vivo la différenciation, on observe une forte amplification des progéniteurs érythroïdes, une induction de la différenciation exclusivement vers la lignée érythroïde et une maturation complète du stade de globules rouges énucléés. Ainsi, ce système fournit une occasion d'étudier le mécanisme moléculaire de régulation transcriptionnelle de cellules souches progresser sur la lignée érythroïde hématopoïétiques.

Etudier l'érythropoïèse au niveau transcriptionnel nécessite également la capacité de sur-exprimer ou knockdown facteurs spécifiques dans les cellules érythroïdes primaires. Pour ce faire, nous utilisons un système de lentivirus médiation du gène qui permet la livraison de l'infection efficace de diviser et de deux cellules ne se divisant 7. Ici, nous montrons que nous sommes en mesure de l'efficacité knockdown TAL1 facteur de transcription dans les cellules érythroïdes primaires humains. En outre, l'expression de la GFP démontre une efficacité d'infection lentiviraux près de 90%. Ainsi, notre protocole fournit un système très utile pour la caractérisation du réseau de régulation des facteurs de transcription de contrôle qui l'érythropoïèse.

Protocole

Partie I. Érythropoïèse ex vivo des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques humaines

1. Isolement des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques humaines CD34+

La population de cellules CD34+ humaines, qui contient un mélange de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et de précurseurs précoces 8, est prélevée à partir de sang de cordon ombilical, de sang périphérique mobilisé avec du G-CSF (leucaphérèse) ou de moelle osseuse (Figure 1-Étape 1). Si vous utilisez du sang de cordon ou du sang périphérique, passez directement à l'étape 1.2. Si vous utilisez de la moelle osseuse, commencez à l'étape 1.1. Pour les réactifs et l'équipement, voir le Tableau 1.

Cette étape est réalisée dans des conditions stériles (c.-à-d. sous hotte) et à température ambiante (RT), sauf indication contraire.

  1. Préparer une suspension monocellulaire de moelle osseuse :
    1. Resuspendre la moelle dans 10 volumes de RPMI 1640 contenant 0,02 % de collagénase B et 100 U/ml d'ADNase 1
    2. Mélanger doucement sur un agitateur de balance pendant 45 min.
    3. Filtrer les cellules à travers une maille en nylon de 30 μm.
  2. Isoler les cellules mononucléées (CMN) de faible densité par centrifugation en gradient de densité sur Ficoll :
    1. Diluer la suspension sanguine ou médullaire avec 2 à 4 volumes de PBS contenant 2 % de sérum de veau fœtal (SVF) et 2 mM de EDTA. N.B. Des volumes plus élevés augmentent la pureté des CSM.
    2. Dans un tube conique de 50 ml, déposer soigneusement 35 ml de suspension cellulaire diluée au-dessus de 15 ml de Ficoll-Paque. Centrifuger à 400g pendant 30 min. dans un rotor à godets oscillants, sans frein.
    3. Aspirez la couche supérieure en laissant intacte la couche intermédiaire des cellules mononucléées (MNC).
    4. Transférez la couche d'interphase (contenant les MNC) vers un nouveau tube conique de 50 ml.
    5. Ajouter du PBS contenant 2 % de FBS et 2 mM de EDTA pour remplir ce tube, mélanger délicatement en renversant le tube et centrifuger à 300g pendant 10 min à température ambiante. Éliminer le surnageant.
    6. Lavez le culot cellulaire 2 fois supplémentaires pour éliminer les plaquettes. N.B. Cette étape augmente la pureté des cellules CD34+ cellules
    7. Prendre 20 μl de suspension cellulaire et placer dans un tube Eppendorf. Ajouter 200 μl de tampon de lyse des érythrocytes (Tableau 1) et incuber 2 min à température ambiante. Déposer 18 μl de cette suspension sous une hématimètre et dénombrer les MNC nucléés.
    8. Les MNC peuvent être utilisées immédiatement ou congelées à 108 cellules/ml dans un milieu de culture contenant 10 % de DMSO et stockées dans l'azote liquide.
  3. Isoler les cellules CD34+ cellules par sélection immunomagnétique positive (Figure 1-Étape 1)
    Nous utilisons le CD34 Microbead Kit (contenant une solution de microbilles conjuguées à des anticorps monoclonaux murins anti-CD34 humain et une solution de réactif bloquant les récepteurs Fc, contenant des IgG humaines) en combinaison avec deux colonnes LS Mini-MACS, le AutoMACS Running Buffer et un séparateur MiniMACS (tableau 1). Nous décrivons ci-dessous notre protocole à partir de 2,3 × 10⁸8 MNC. Si des nombres différents de cellules sont utilisés, les volumes doivent être ajustés proportionnellement. En outre, pour un nombre allant jusqu'à 2x108 Des colonnes MNCs à MS MiniMacs peuvent être utilisées à la place des colonnes LS MiniMacs.
    Gardez les cellules et les réactifs au froid (4-8 °C) pour éviter la formation de caps sur les anticorps à la surface des cellules et l'étiquetage cellulaire non spécifique.
    1. Resuspendre le culot contenant 2,3x108 MNC dans 690 μl de tampon de migration (300 μl par 108 MNC, où 300 μl est le volume minimal de suspension requis) et transférer dans un tube conique de 15 ml.
    2. Ajouter 230 μl de réactif de blocage des FcR
    3. Ajouter 230 μl de solution de microbilles CD34.
    4. Bien mélanger à la main et incuber 30 min. à 4 °C.
    5. Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon de lavage et centrifuger à 300g pendant 10 min.
    6. Aspirez complètement le surnageant.
    7. Resuspendre les cellules dans 1,2 ml de tampon de migration (utiliser 0,5 ml de tampon par 108 MNC N.B. Il est important d'obtenir une suspension monocellulaire avant la séparation magnétique. Si nécessaire, faire passer les cellules à travers un tamis en nylon de 30 μm pour éliminer les agrégats cellulaires.
    8. Préparer la colonne LS en la plaçant dans le champ magnétique d'un séparateur MiniMACS.
    9. Rincer la colonne avec 3 ml de tampon de lavage.
    10. Appliquer 1,2 ml de suspension cellulaire sur la colonne.
    11. Recueillir l'écoulement et l'utiliser pour vérifier le rendement et la pureté des CD34+ isolement cellulaire. Sinon, congeler les cellules contenues dans cette fraction et les conserver dans de l'azote liquide. N.B. Cette fraction contient des cellules non marquées et peut également contenir quelques cellules CD34 marquées+ les cellules qui ne se sont pas fixées sur la colonne.
    12. Lavez la colonne trois fois avec 3 ml de tampon de lavage, réunissez les éluats et utilisez cette fraction de manière similaire à la fraction du flux initial mentionnée ci-dessus.
    13. Retirez la colonne de l'aimant et placez-la sur un tube de collecte en polypropylène de 15 ml.
    14. Pour éluer les cellules, ajouter 5 ml de tampon de lavage sur la colonne et éluer immédiatement les cellules CD34 marquées+ cellules en appuyant fermement le piston dans la colonne.
    15. Répétez la procédure de purification sur colonne (étapes h à n) en faisant passer les cellules sur une colonne LS fraîchement préparée. N.B. Cela augmente la pureté des cellules CD34+ cellules. À partir d'une suspension de 2,3x108 Les MNC isolées par leucaphérèse, on obtient typiquement 1,1x106 CD34+ cellules avec une pureté > 95 ± 3 % (Figure 1-Étape 1).
    16. Congeler les cellules dans un milieu de culture contenant 10 % de DMSO et les conserver en azote liquide ou passer directement à l'étape 2).

2. Différenciation érythroïde en culture cellulaire

Les cellules CD34+ sont cultivées dans un milieu IMDM supplémenté avec une administration séquentielle d'hydrocortisone et de combinaisons spécifiques de cytokines selon un protocole en quatre étapes adapté de 6 (Figure 1-Étape 2). Une série de tests est réalisée tout au long de la procédure afin de vérifier la croissance cellulaire et la différenciation érythroïde.

Le nombre de cellules CD34+ nécessaires pour initier une culture varie selon l'échelle de l'expérience. Généralement, pour des études d'expression génique, nous réalisons une culture à petite échelle en partant de 0,1x106 cellules CD34+ dans 10 ml de milieu, en conservant des volumes réduits en congelant les cellules excédentaires au cours du protocole. Pour les études nécessitant une extraction protéique, les cultures sont réalisées à plus grande échelle. Ici, nous décrivons une expérience à grande échelle où nous démarrons avec environ 7x106 cellules CD34+ isolées à partir d'une leucaphérèse.
Des conditions stériles sont utilisées tout au long du processus. Voir les tableaux 1, 2 et 3 pour les réactifs.

  1. Préparer les réactifs
    1. Préparer le milieu IMDM supplémenté comme décrit dans le tableau 2 et congeler des aliquots de 40 ml à -20°C (peut être fait à l'avance).
    2. Préparer des solutions mères d'hydrocortisone et de cytokines comme décrit dans le tableau 3.
  2. Étape 1 : Jour 0-11
    Les cellules hématopoïétiques sont cultivées dans un milieu IMDM supplémenté contenant de l'hydrocortisone (HC), le facteur de cellules souches (SCF), l'interleukine 3 (IL-3) et l'érythropoïétine (EPO) (tableau 3). Les cellules stromales de moelle osseuse murine MS-5 (tableau 1) sont amplifiées en prévision de l'étape 2.
    • Jour 0 :
      1. Préchauffer 120 ml de milieu IMDM supplémenté et ajouter HC, SCF, IL-3 et EPO (tableau 3).
      2. Dégeler 7x106 cellules CD34+ en plaçant d'abord le(s) flacon(s) dans un bain-marie à 37°C. Tant que les cellules sont encore congelées, ajouter 1 ml de milieu préchauffé et transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml. Rincer le flacon avec 2 ml de milieu et transférer dans le tube de 15 ml.
      3. Ajouter 6 ml de milieu au culot cellulaire, mélanger en retournant le tube et centrifuger à 200 g pendant 5 min.
      4. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 10 ml de milieu frais.
      5. Compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre après avoir mélangé 10 μl de suspension cellulaire avec 10 μl de solution de bleu de Trypan (tableau 1). NB : La mort cellulaire est d’environ 25 % lors du dégel, donc la concentration de cellules vivantes devrait être d’environ ~0,5x106 cellule/ml.
      6. Conserver environ 3 ml de suspension cellulaire pour les tests (voir paragraphe 6).
      7. Transférer les 7 ml restants dans un flacon T-175 et ajouter 63 ml de milieu pour obtenir une concentration de 0,05x106 cellule/ml dans un volume total de 70 ml, puis placer le flacon dans un incubateur à 37°C.
    • Jour 1 :
      1. Préchauffer 85 ml de milieu de culture des cellules MS-5 : αMEM avec Glutamax (tableau 1), 10 % de SFB et 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine.
      2. Préparer trois boîtes de culture rondes de 150 mm x 25 mm, chacune ensemencée avec 2x106 cellules MS-5 dans 25 ml de milieu pour obtenir une concentration de 0,08x106 cellule/ml, puis placer dans un incubateur à 37°C. NB : Les meilleurs résultats sont obtenus avec des cellules MS-5 de faible passage (<20). La culture conflue doit être agrandie en divisant 1:5 tous les trois jours à l’aide de trypsine contenant 0,05 % d’EDTA.
    • Jour 2 :
      1. Compter les cellules hématopoïétiques avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter les cellules nécessaires (c.-à-d. ~20 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : Selon notre expérience, durant les deux premiers jours, la mort cellulaire peut dépasser 30-50 %, et la concentration finale des cellules est généralement proche de celle du jour 0 (figure 2).
      2. Remplacer le milieu de culture des cellules MS-5 par 25 ml de milieu frais en s'assurant d'éliminer les cellules MS-5 non adhérentes.
    • Jour 4 :
      1. Compter les cellules hématopoïétiques avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter les cellules nécessaires (c.-à-d. ~10 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : À ce stade, les cellules devraient avoir commencé à proliférer avec >75 % de cellules viables à une concentration d’environ ~0,2x106 cellule/ml. Les cellules peuvent être congelées à 1-2x106 cellule/ml dans du milieu IMDM supplémenté contenant 10 % de DMSO et stockées dans l’azote liquide.
      2. Transférer les ~40 ml restants de culture dans un flacon T-175 et ajouter suffisamment de milieu IMDM supplémenté contenant HC, SCF, IL-3 et EPO (tableau 3) pour atteindre un volume final de 150 ml. NB : La concentration cellulaire devrait être d’environ ~0,05x106 cellule/ml.
      3. Amplifier les cellules MS-5 (qui devraient être à 60-70 % de confluence) en les diluant 1:5 dans de nouvelles boîtes de culture rondes de 150 mm x 25 mm à l’aide de trypsine 0,05 % EDTA. La concentration finale en cellules devrait être d’environ ~0,08x106 cellule/ml. NB : Habituellement, une boîte peut être amplifiée 5 fois, de sorte que vous devriez disposer de 15 boîtes de cellules MS-5 à ~0,08x106 cellule/ml.
    • Jour 6 :
      1. Compter les cellules hématopoïétiques avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter le nombre nécessaire de cellules (c.-à-d. ~5 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : Les cellules sont en phase de forte prolifération et la concentration cellulaire doit être maintenue ≤1,5x106 cellule/ml. Si la concentration est plus élevée, ajouter du milieu IMDM supplémenté frais contenant HC, SCF, IL-3 et EPO.
    • Jour 7 :
      1. Compter les cellules hématopoïétiques avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes. NB : Selon notre expérience, les cellules atteignent généralement une densité de 1,5x106 cellule/ml au jour 7.
      2. Ajouter suffisamment de milieu pour maintenir une concentration cellulaire d’environ ~0,8x106 cellule/ml. NB : Nous ajoutons généralement 100 ml de milieu IMDM supplémenté frais contenant HC, SCF, IL-3 et EPO pour obtenir 245 ml de cellules à ~0,8x106 cellule/ml.
      3. Amplifier les cellules MS-5 (qui devraient être à 60-70 % de confluence) en les diluant 1:5 dans des flacons T-175 (au lieu des boîtes) à l’aide de trypsine 0,05 % EDTA. La concentration finale en cellules devrait être d’environ ~0,08x106 cellule/ml. NB : 61 flacons de cellules MS-5 à ~0,08x106 cellule/ml doivent être préparés. Congeler les cellules MS-5 restantes et les stocker dans l’azote liquide.
    • Jour 8 :
      1. Compter les cellules hématopoïétiques avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter le nombre nécessaire de cellules (c.-à-d. ~5 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : La densité cellulaire devrait être d’environ ~1x106 cellule/ml.
      2. Préchauffer 2 L de milieu IMDM supplémenté contenant uniquement SCF et EPO (tableaux 2 et 3).
      3. Récupérer 200 ml de culture hématopoïétique (contenant ~200x106 cellules), centrifuger à 200 g pendant 10 min, aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 40 ml de milieu IMDM supplémenté contenant SCF et EPO.
      4. Répartir la suspension cellulaire dans 8 flacons T-175 (5 ml par flacon) et ajouter 245 ml de milieu IMDM supplémenté contenant SCF et EPO à chaque flacon. NB : Nous disposons maintenant de 8 flacons, chacun contenant 250 ml de cellules à 0,1x106 cellule/ml.
      5. Les cellules restantes (~40 ml) au jour 8 peuvent être congelées à 1-2x106 cellule/ml dans du milieu IMDM supplémenté contenant 10 % de DMSO et stockées dans l’azote liquide.
    • Jour 10 :
      1. Compter les cellules hématopoïétiques avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter le nombre nécessaire de cellules (c.-à-d. ~5 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : La densité cellulaire devrait être d’environ ~1x106 cellule/ml.
  3. Étape 2 : Jours 11-15
    Environ la moitié des cellules sont récoltées pour une utilisation ultérieure (p. ex. extraction nucléaire). Les cellules érythroïdes restantes sont cultivées en co-culture sur des cellules MS-5 dans un milieu IMDM supplémenté contenant EPO (tableaux 2 et 3). Les cellules érythroïdes doivent être transférées sur une nouvelle couche de cellules MS-5 tous les 3-4 jours.
    • Jour 11 :
      1. Compter les cellules érythroïdes avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes. NB : La densité cellulaire devrait être d’environ ~1,5x106 cellule/ml.
      2. Préchauffer 1 L de PBS 1x, 400 ml de milieu IMDM supplémenté et 5 L de milieu IMDM supplémenté contenant EPO (tableaux 2 et 3) à 37°C.
      3. Réserver un volume de culture équivalent à 15x108 cellules (p. ex. ~4 flacons de 250 ml chacun) et passer à l’étape e.
      4. Les cellules restantes (p. ex. 15x108) sont récoltées dans des tubes coniques, centrifugées à 450 g pendant 10 min, resuspendues dans du tampon MS30 froid (tableau 5) contenant 0,1 mM de DTT en utilisant un maximum de 108 cellule/ml et stockées à -80°C après congélation rapide dans l’azote liquide pour une utilisation ultérieure (p. ex. extrait nucléaire).
      5. Laver 50 flacons de cellules MS-5 confluentes avec 20 ml de PBS 1x chacun, puis ajouter immédiatement 80 ml de milieu IMDM supplémenté frais contenant EPO dans chaque flacon. NB : En raison du grand nombre de flacons, nous traitons 4 flacons à la fois. Plus précisément, nous retirons 4 flacons de cellules MS-5 confluentes de l’incubateur, les lavons avec du PBS 1x, ajoutons les 80 ml de milieu, puis les replaçons dans l’incubateur. Lorsque tous les flacons sont préparés et replacés dans l’incubateur, nous passons à l’étape f. En raison du nombre élevé de flacons à traiter pour une procédure à grande échelle, il est avantageux que deux personnes effectuent ces étapes simultanément.
      6. Centrifuger l’équivalent de 15x108 cellules érythroïdes dans 4 tubes coniques à 450 g pendant 10 min et jeter le surnageant.
      7. Laver les 4 culots cellulaires avec 100 ml chacun de milieu IMDM supplémenté.
      8. Resuspendre chaque culot cellulaire dans 250 ml de milieu IMDM supplémenté contenant EPO et répartir 20 ml de cette suspension cellulaire dans chacun des 50 flacons contenant des cellules MS-5 et 80 ml de milieu. NB : À cette étape, vous devriez avoir 50 flacons avec des cellules MS-5 confluentes contenant 100 ml de cellules érythroïdes à 0,3x106 cellule/ml.
      9. Amplifier les 11 flacons restants de cellules MS-5 en les diluant 1:5 dans des flacons T-175 à l’aide de trypsine 0,05 % EDTA. La concentration finale en cellules devrait être d’environ ~0,08x106 cellule/ml. NB : 55 flacons de cellules MS-5 à ~0,08x106 cellule/ml doivent être préparés.
    • Jour 12 :
      1. Compter les cellules érythroïdes avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter le nombre nécessaire de cellules (c.-à-d. ~4 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : La densité cellulaire devrait être d’environ ~0,6x106 cellule/ml.
    • Jour 14 :
      1. Compter les cellules érythroïdes avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter le nombre nécessaire de cellules (c.-à-d. ~3 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : La densité cellulaire devrait être d’environ ~0,9x106 cellule/ml.
  4. Étape 3 : Jours 15-18
    Certaines cellules sont récoltées pour une utilisation ultérieure (p. ex. extraction nucléaire). Les cellules érythroïdes restantes sont cultivées en co-culture sur des cellules MS-5 dans un milieu IMDM supplémenté sans cytokines.
    • Jour 15 :
      1. Compter les cellules érythroïdes avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes. NB : La densité cellulaire devrait être d’environ ~1x106 cellule/ml.
      2. Préchauffer 1 L de PBS 1x et 5 L de milieu IMDM supplémenté (tableau 2) à 37°C.
      3. Réserver un volume de culture équivalent à 10x108 cellules (p. ex. ~10 flacons de 100 ml chacun) et passer à l’étape e.
      4. Les cellules restantes (p. ex. 40x108) sont récoltées et resuspendues dans du tampon MS30 froid (tableau 5) contenant 0,1 mM de DTT pour une utilisation ultérieure (voir étape 2 : jour 11 point d).
      5. Laver 50 flacons de cellules MS-5 confluentes avec 20 ml de PBS 1x chacun et ajouter immédiatement 80 ml de milieu IMDM supplémenté frais dans chaque flacon.
      6. Centrifuger l’équivalent de 10x108 cellules érythroïdes dans 4 tubes coniques à 450 g pendant 10 min et jeter le surnageant.
      7. Laver les 4 culots cellulaires avec 100 ml chacun de milieu IMDM supplémenté.
      8. Resuspendre chaque culot cellulaire dans 250 ml de milieu IMDM supplémenté et répartir 20 ml de cette suspension cellulaire dans chacun des 50 flacons contenant des cellules MS-5 et 80 ml de milieu. NB : À cette étape, vous devriez avoir 50 flacons avec des cellules MS-5 confluentes contenant 100 ml de cellules érythroïdes à 0,2x106 cellule/ml.
      9. Amplifier les 5 flacons restants de cellules MS-5 en les diluant 1:5 dans des flacons T-175 à l’aide de trypsine 0,05 % EDTA. La concentration finale en cellules devrait être d’environ ~0,08x106 cellule/ml. NB : 20 flacons de cellules MS-5 à ~0,08x106 cellule/ml doivent être préparés. Congeler les cellules MS-5 restantes et les stocker dans l’azote liquide.
    • Jour 16 :
      1. Compter les cellules érythroïdes avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter le nombre nécessaire de cellules (c.-à-d. ~4 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : La densité cellulaire devrait être d’environ ~0,6x106 cellule/ml.
  5. Étape 4 : Jours 18-26
    Les cellules érythroïdes sont concentrées 3 à 4 fois pour atteindre une concentration finale de 5-7x106 cellule/ml et maintenues sur une couche de cellules MS-5 pour permettre leur maturation. 10 % de SFB est ajouté au milieu IMDM supplémenté pour assurer une meilleure conservation des globules rouges cultivés (cRBCs).
    • Jour 18 :
      1. Compter les cellules érythroïdes avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter le nombre nécessaire de cellules (c.-à-d. ~2 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : La densité cellulaire devrait être d’environ ~1,7x106 cellule/ml.
      2. Préchauffer 300 ml de PBS 1x et 1,5 L de milieu IMDM supplémenté (tableau 2) contenant 10 % de SFB à 37°C.
      3. Laver 15 flacons de cellules MS-5 confluentes avec 20 ml de PBS 1x chacun et ajouter immédiatement 80 ml de milieu IMDM supplémenté frais dans chaque flacon.
      4. Centrifuger les cellules érythroïdes (c.-à-d. l’équivalent de 85x108 cellules) à 450 g pendant 10 min, combiner et répartir le culot dans 4 tubes coniques.
      5. Resuspendre chaque culot cellulaire dans 75 ml de milieu IMDM supplémenté contenant 10 % de SFB et répartir 20 ml de cette suspension cellulaire dans chacun des 15 flacons contenant des cellules MS-5 et 80 ml de milieu. NB : À cette étape, vous devriez avoir 15 flacons avec des cellules MS-5 confluentes contenant 100 ml de cellules érythroïdes à 6x106 cellule/ml.
      6. Amplifier les 5 flacons restants de cellules MS-5 en les diluant 1:5 dans des flacons T-175 à l’aide de trypsine 0,05 % EDTA. La concentration finale en cellules devrait être d’environ ~0,08x106 cellule/ml. NB : 20 flacons de cellules MS-5 à ~0,08x106 cellule/ml doivent être préparés. Congeler les cellules MS-5 restantes et les stocker dans l’azote liquide.
    • Jour 20 :
      1. Compter les cellules érythroïdes avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter le nombre nécessaire de cellules (c.-à-d. ~1,5 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : La densité cellulaire est maintenue à environ ~1,5x106 cellule/ml.
    • Jour 22 :
      1. Compter les cellules érythroïdes avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter le nombre nécessaire de cellules (c.-à-d. ~1,5 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : La densité cellulaire est maintenue à environ ~1,5x106 cellule/ml.
      2. Changer le milieu et transférer les cellules érythroïdes sur de nouvelles couches de cellules MS-5 comme décrit pour le jour 18.
    • Jour 24 :
      1. Compter les cellules érythroïdes avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter le nombre nécessaire de cellules (c.-à-d. ~1,5 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : La densité cellulaire est maintenue à environ ~1,5x106 cellule/ml.
    • Jour 26 :
      1. Compter les cellules érythroïdes avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, et récolter le nombre nécessaire de cellules (c.-à-d. ~1,5 ml de culture) pour les tests (voir paragraphe 6). NB : La densité cellulaire est maintenue à environ ~1,5x106 cellule/ml.
      2. Récupérer les cRBCs non adhérents, énucléés et complètement hémoglobinisés. NB : Les cRBCs matures peuvent être conservés dans du milieu SAGM (MacoPharma) à 4°C pendant un mois au maximum.
  6. Tests et résultats représentatifs
    Les tests suivants sont effectués aux jours indiqués pour vérifier la prolifération cellulaire adéquate et la différenciation érythroïde. Les résultats représentatifs présentés sur les figures ont été obtenus à l’aide de cellules CD34+ isolées de leucaphérèse.
    1. Les cellules sont comptées tous les deux jours. Voir le résultat représentatif de la prolifération cellulaire sur la figure 2.
    2. La coloration morphologique de May-Grünwald Giemsa est réalisée tous les deux jours en utilisant 0,05 x106 cellules pour les jours 0 à 8 et 0,2x106 cellules pour les autres jours, selon les instructions du fabricant de la coloration Giemsa (tableau 1). Voir les résultats représentatifs sur la figure 3.
    3. Des tests en milieu semi-solide sont réalisés en double pour mesurer les progéniteurs hématopoïétiques tous les deux jours du jour 0 au jour 12 en utilisant 0,01x106 cellules par test, selon les instructions du fabricant du milieu semi-solide Methocult (tableau 1). Voir les résultats représentatifs sur la figure 4.
    4. L’analyse des marqueurs cellulaires suivants est réalisée tous les deux jours par cytométrie en flux (FACS) : CD34, CD36, CD71, GPA, LDS en utilisant 0,2 x106 cellules par test. Voir les résultats représentatifs sur la figure 5.
    5. L’hémoglobine est mesurée tous les deux jours par coloration au benzidine. Voir les résultats représentatifs sur la figure 5.
    6. L’expression génique est étudiée par RT-qPCR ou microarray après extraction d’ARN à partir de 1x106 cellules. Voir les résultats représentatifs sur la figure 6B.

Commentaires sur les résultats :

La Figure 1 illustre le protocole de différenciation ex vivo de cellules CD34+ humaines en globules rouges matures contenant de l'hémoglobine. Au cours de la différenciation érythroïde, les cellules sont fortement prolifératives, comme le montre l'amplification d'environ 8 000 fois indiquée sur la Figure 2, obtenue à l'aide de cellules CD34+ isolées par leucaphérèse. Les cellules CD34+ isolées de la moelle osseuse sont légèrement moins prolifératives, avec une amplification d'environ 6 000 fois, tandis que les cellules CD34+ isolées du sang de cordon peuvent atteindre une amplification de 50 000 fois. Les cellules à des stades particuliers de différenciation présentent des tailles et des morphologies reconnaissables, illustrées sur la Figure 3. Remarquez le processus d'énucléation qui se produit à la fin de la différenciation, à partir du jour 20. Au jour 26, toutes les cellules ont perdu leur noyau (Figure 3).

Les essais de formation de colonies présentés sur la Figure 4 sont utilisés pour détecter les progéniteurs hématopoïétiques précoces et tardifs au cours des premiers jours de différenciation (jour 0 à jour 8). En plus des progéniteurs érythroïdes (CFU-E et BFU-E), nous observons que les progéniteurs granulocytaires et macrophagiques (CFU-GM) sont largement représentés parmi les cellules précoces CD34+ au jour 0. Au fur et à mesure que la différenciation progresse, les CFU-GM diminuent fortement et, au jour 6, ils ont été complètement remplacés par les progéniteurs érythroïdes BFU-E et CFU-E. Il est également important de noter que, du jour 4 au jour 6, les progéniteurs érythroïdes précoces BFU-E sont progressivement remplacés par leurs homologues plus différenciés, les CFU-E. Au jour 10, les cellules érythroïdes ont essentiellement perdu leur capacité de formation de colonies.

Enfin, l'érythropoïèse est surveillée par l'expression de marqueurs de surface cellulaire, comme illustré à la Figure 5. Remarque : 1) la perte progressive du marqueur des cellules souches/progéniteurs hématopoïétiques CD34 ; 2) l'acquisition puis la perte progressive du marqueur progéniteur CD36 ; 3) l'acquisition puis la perte progressive du marqueur des progéniteurs érythroïdes et des réticulocytes CD71 ; et 4) l'augmentation du marqueur des précurseurs érythroïdes et des érythrocytes GPA. D'autres marqueurs de la différenciation érythroïde incluent la synthèse d'hémoglobine à partir du jour 8 (mesurée par coloration au benzidine — Figure 5) et l'énucleation cellulaire à partir du jour 20, évaluée par la perte de la coloration ADN LDS (Figure 5). Enfin, la différenciation érythroïde peut être mesurée par RT-qPCR de marqueurs moléculaires tels que le facteur de transcription TAL1 (Figure 6B) ou les gènes de la β-globine (données non montrées).

Typiquement, 1 ml de sang de cordon / leucaphérèse / moelle osseuse fournit 0,35x105 / 0,5x105 / 1,1x105 cellules CD34+ qui peuvent théoriquement produire 1,7x109 / 0,4x109 / 0,7x109 globules rouges avec des taux de prolifération respectifs de 50 000 / 8 000 / 6 000. Pour obtenir 50x106 globules rouges à la fin de la procédure de différenciation, vous aurez besoin d’environ 50 ml de milieu de culture.

Deuxième partie. Inhibition par lentivirus au cours de la différenciation érythroïde ex vivo

Le lentivirus est un outil de choix pour le transfert de gènes dans les cellules primaires humaines (voir par exemple Amsellem et al. 9). Les lentivirus sont souvent utilisés pour inhiber l'expression de gènes d'intérêt dans les cellules primaires par l'intermédiaire d'une livraison d'ARNh ciblé (voir par exemple Laurenti et al. 10). Dans ce protocole, nous ciblons le facteur de transcription TAL1 dans des cellules érythroïdes primaires humaines. Un ARNh portant une séquence aléatoire qui ne correspond à aucun gène connu est utilisé comme témoin négatif. L'expression de la GFP est utilisée pour évaluer l'efficacité de la transduction.

1. Préparation des particules de vecteurs rétroviraux lentiviraux

Pour obtenir des particules lentivirales, des cellules humaines du rein embryonnaire 293T sont cotransfectées avec trois plasmides : l'un comprenant un système d'emballage viral de deuxième génération codant pour les gènes du VIH-1 à l'exception de env, vpr, vif, vpu et nef (c'est-à-dire psPAX2) ; un autre codant pour l'enveloppe du virus pseudotypé par la glycoprotéine G de la stomatite vésiculeuse (c'est-à-dire pMD2G) ; et un vecteur lentiviral codant pour le gène d'intérêt (c'est-à-dire pBLOCK-it6-DEST(shTal1) codant pour un ARNsh ciblant TAL1, pBLOCK-it6-DEST(shScr) codant pour un ARNsh aléatoire ou pWPIP codant pour la GFP) (Tableau 4). Les particules lentivirales sont recueillies à partir du surnageant de culture des cellules 293T transfectées.

Pour éviter toute infection non souhaitée des cellules, nous réalisons toutes les expériences avec des lentivirus (préparation des virus et infection) sous une hotte dédiée, séparée des autres cultures cellulaires. De plus, les déchets contenant des lentivirus sont éliminés séparément. Les lentivirus de deuxième génération décrits dans ce protocole sont incapables de se répliquer et doivent être manipulés comme des agents de niveau de biosécurité 2. Certaines institutions peuvent avoir des procédures de sécurité spécifiques concernant les lentivirus, et nous vous recommandons de suivre les directives institutionnelles établies.

Nous décrivons ici un protocole permettant d'obtenir suffisamment de particules lentivirales pour infecter de 1 à 2 millions de cellules érythroïdes primaires à n'importe quelle étape de différenciation. Les volumes doivent être ajustés en conséquence en cas d'augmentation ou de réduction d'échelle. Voir les tableaux 4 et 5 pour les réactifs.

  1. Transfection de cellules 293T par phosphate de calcium.
    1. Un jour avant la transfection, ensemencer 13,2 x 106 Cellules 293T dans 20 ml de milieu DMEM/haute teneur en glucose contenant 10 % de SFB et de Pen/Strep dans une boîte de culture cellulaire de 15 cm. NB. Cela doit permettre aux cellules d'atteindre une confluence de 70 % le jour de la transfection. Les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant des cellules de bas passage (<20) Cellules 293T.
      Facultatif : les plaques peuvent être recouvertes de collagène de type I ou de poly-L-lysine afin d'améliorer l'adhérence des cellules 293T.
    2. Deux heures avant la transfection, aspirer le milieu des cellules 293T et ajouter délicatement 20 ml de milieu frais préchauffé à 37 °C. NB : Nous commençons généralement la transfection en fin de journée.
    3. Mélanger les réactifs suivants dans un tube de 5 ml :
      • 44,8 μg de vecteur d'expression pour votre gène d'intérêt (par exemple, ARNsh ou GFP — voir tableau 4)
      • 13,35 μg de vecteur d'enveloppe pMD2.G
      • 33,48 μg de vecteur d'emballage psPAX2.
      • Ajouter suffisamment d'eau stérile H2O pour compléter le volume à 1,116 ml.
    4. Ajouter suffisamment d'eau stérile H2O pour obtenir un volume final de 1,116 ml.
    5. Ajouter 109,8 μl de CaCl2 2,5 M et vortexer pour homogénéiser.
    6. Dans un tube conique de 50 ml, ajouter 1,116 ml de tampon 2xHBS (tableau 5).
    7. Sous agitation vortex constante, ajouter le mélange d'ADN goutte à goutte dans le tampon 2xHBS.
    8. Laisser le précipité se former à température ambiante pendant 20 min. (pas plus de 30 min.).
    9. Ajouter la solution de 2,3 ml goutte à goutte dans la boîte contenant les cellules 293T, agiter doucement et transférer les cellules dans un incubateur à 37 °C pendant 12 à 14 heures.
    10. Tôt le lendemain matin, aspirez le milieu et remplacez-le par 20 ml de milieu frais préchauffé à 37 °C.
  2. Récolte et concentration du lentivirus
    1. Quarante-huit heures après la transfection, récolter 20 ml de milieu contenant le lentivirus et placer dans un tube conique de 50 ml.
    2. Ajouter 20 ml de milieu préchauffé à 37 °C aux cellules 293T et remettre au laboratoire de culture.
    3. Centrifuger le surnageant viral à 450 g pendant 10 min pour éliminer les débris cellulaires et transférer dans un nouveau tube de 50 ml. Alternativement, le surnageant peut être filtré à travers un filtre de 0,45 μm. Conserver le surnageant clarifié à 4 °C.
    4. Vingt-quatre heures plus tard, récolter les 20 ml restants de milieu. NB : Nous constatons que les titres viraux sont approximativement équivalents dans les deux récoltes, c'est-à-dire 1 x 106 U.T./ml
    5. Pour concentrer les virus, les surnageants viraux sont répartis dans des tubes Beckman OptiSeal (utiliser 32,4 ml de surnageant par tube) et centrifugés à 100 000g pendant 1,5 h à 4 °C à l’aide d’un rotor à bille. N.B. Des méthodes alternatives permettant de concentrer le surnageant viral incluent une centrifugation à 47 000 g pendant 2 h ou à 3 000 g pendant 8 h. Ne pas congeler le virus avant la concentration. Le congélation provoque la précipitation des protéines, ce qui rend difficile la resuspension du virus.
    6. Immédiatement après l'ultracentrifugation, aspirez lentement le surnageant à l'aide d'une pipette plastique de 10 ml et jetez-le. NB : Veillez à ne pas perturber le culot, qui peut facilement se détacher du tube. Après avoir éliminé les 5 premiers ml de surnageant, nous avons l'habitude de couper le haut du tube d'ultracentrifugation afin d'éliminer autant que possible le surnageant, c'est-à-dire de laisser environ 100-200 μl de milieu au fond du tube.
    7. Ajouter 100 μl de PBS 1x, laisser le culot se dissoudre à température ambiante pendant 30 min et resuspendre en pipetant de haut en bas 15 à 20 fois. NB : nous obtenons généralement environ 200 à 300 μl de virus concentré.
    8. La préparation concentrée de lentivirus est titrée sur des cellules NIH3T3 en utilisant un protocole d'Invitrogen (système d'expression Block-it d'ARNi lentiviral). NB : Nous obtenons généralement des titres viraux de 2 à 10x108 unités de transduction (UT)/ml
    9. Le virus peut désormais être utilisé pour une infection (voir paragraphe 2) ou aliquoté et conservé à -80 °C pendant jusqu'à 6 mois. NB : Ne soumettez pas les suspensions virales à plus d'un cycle de congélation-dégel. Les virus sont stables pendant 4 à 5 heures à 37 °C, 2 à 3 jours à température ambiante ou une semaine à 4 °C.

2. Infection lentivirale de cellules érythroïdes primaires pour la livraison de gènes

  1. Infection
    Les cellules érythroïdes nucléées peuvent être efficacement infectées à n'importe quelle étape de différenciation, à condition d'utiliser un taux de multiplicité d'infection (MOI) élevé, compris entre 50 et 100. Nous décrivons ici une expérience typique dans laquelle des lentivirus exprimant un ARNsh ciblant TAL1 ou un ARNsh contrôle aléatoire (scramble) sont utilisés pour infecter des cellules érythroïdes aux jours 8 et 9 de différenciation, avec un MOI de 50 UT/cellule. L'ARN est extrait toutes les 24 heures afin de vérifier le niveau de silençage de TAL1 par RT-qPCR. L'expression de la GFP est mesurée en parallèle par cytométrie en flux pour évaluer l'efficacité d'infection (voir résultats représentatifs à la Figure 6).
    • Jour 0 :
      1. Préparer trois tubes coniques de 15 ml contenant chacun 1x106 cellules érythroïdes (c'est-à-dire un tube pour l'invalidation de TAL1, un tube pour le contrôle négatif aléatoire, un tube pour le contrôle d'expression de la GFP).
      2. Laver les cellules avec 5 ml de milieu IMDM supplémenté contenant le SCF et l'EPO (voir Partie I), centrifuger à 200 g pendant 5 min et éliminer autant que possible le surnageant.
      3. Ajouter du polybrene (Tableau 4) à une concentration finale de 40 μg/ml dans la solution de virus concentrée.
      4. Ajouter 100 μl de virus concentré (c'est-à-dire 5x107 UT) contenant du polybrene à chaque tube de cellules érythroïdes.
      5. Incuber pendant 1 h dans l'incubateur à 37°C et mélanger en tapotant délicatement chaque tube toutes les 10 min. N.B. l'infection doit être réalisée avec un volume minimal de milieu afin de permettre une adsorption maximale du lentivirus sur les cellules. En outre, le mélange toutes les 10 min. assure une répartition homogène du virus parmi les cellules.
      6. Ajouter 900 μl de milieu IMDM supplémenté contenant le SCF et l'EPO (Tableaux 2 et 3) dans chaque tube.
      7. Transférer chaque échantillon dans une plaque 6-puits et placer dans l'incubateur à 37°C pendant 24 h.
    • Jour 1 : Récupérer les cellules dans des tubes de 15 ml séparés, les centrifuger à 200 g pendant 5 min, éliminer le surnageant et répéter l'infection (étapes b à g ci-dessus).
    • Jour 2 : Laver les cellules et les resuspendre à 0,2x106 cellules/ml dans du milieu IMDM supplémenté contenant le SCF et l'EPO, puis poursuivre comme indiqué dans la Partie I.
  2. Résultats représentatifs
    La Figure 6A illustre le protocole d'infection de cellules érythroïdes primaires par lentivirus suivi de l'extraction d'ARN. Dans une expérience, nous avons infecté des cellules érythroïdes avec un lentivirus produisant un ARNsh ciblant le facteur de transcription TAL1 ou un contrôle aléatoire 11. La Figure 6B montre que nous avons réussi à réduire de 75 % les transcrits de TAL1 dans les cellules érythroïdes primaires. On observe également une augmentation du niveau des transcrits de TAL1 entre le jour 9 et le jour 12 dans le contrôle aléatoire, soulignant l'importance de ce facteur de transcription au cours de la différenciation érythroïde. Dans une autre expérience, nous avons infecté des cellules érythroïdes avec un lentivirus exprimant la protéine GFP. La Figure 6C montre que trois jours après l'infection, la majorité des cellules érythroïdes (87 %) expriment la GFP, comme mesuré par fluorescence au microscope et par cytométrie en flux. Cela indique une forte efficacité d'infection dans les cellules érythroïdes primaires. Nous avons précédemment infecté des cellules CD34+ au jour 0 avec une efficacité similaire (données non montrées). Le paramètre le plus important pour une transduction efficace des cellules primaires est d'utiliser un MOI élevé (c'est-à-dire des lentivirus concentrés). Si un faible MOI est utilisé (c'est-à-dire un virus non concentré), l'efficacité de transduction diminuera.

3. Résultats représentatifs

Schéma d'isolement positif des CSH CD34+ ; séparation immunomagnétique, différenciation érythroïde sans sérum.
Figure 1. Schéma du protocole d'isolement et de différenciation érythroïde ex vivo des cellules souches/hématopoïétiques primitives humaines. (Étape 1) Les cellules CD34+ (pureté de 95 ± 3 %) sont isolées à partir de sang de cordon, de moelle osseuse ou de sang périphérique humain mobilisé par le G-CSF (leucaphérèse) par sélection immunomagnétique positive. (Étape 2) Les cellules CD34+ sont cultivées en milieu liquide selon le protocole en quatre étapes indiqué.

Graphique d'amplification cellulaire ; échelle logarithmique ; analyse de la tendance de la croissance cellulaire en fonction des jours de culture.
Figure 2. Amplification cellulaire au cours du protocole de différenciation érythroïde ex vivo. Les résultats sont représentés sur une échelle logarithmique. Résultats représentatifs obtenus avec des cellules CD34+ isolées à partir de leucaphérèse.

Tableau des stades de l'érythropoïèse, images microscopiques du développement des globules rouges sur 26 jours.
Figure 3. Analyse morphologique cellulaire au cours de la différenciation érythroïde ex vivo. Les cellules sont colorées au réactif May-Grünwald-Giemsa aux points temporels indiqués pendant la différenciation (grossissement × 40). HSC : cellules souches/hématopoïétiques progénitrices ; BFU-E : unités formant des colonies érythroïdes en bourgeons ; CFU-E : unités formant des colonies érythroïdes ; Pro EB : pro-érythroblastes ; Baso EB : érythroblastes basophiles ; Poly EB : érythroblastes polychromatophiles ; Ortho EB : érythroblastes orthochromatiques ; RET : réticulocytes ; RBC : globules rouges.

Graphique de l'essai semi-solide ; croissance des progéniteurs CFU-GM, BFU-E, CFU-E ; jours de culture cellulaire ; comparaison d'images.
Figure 4. Essais de cellules formant des colonies (CFC) pour détecter et quantifier les progéniteurs hématopoïétiques. Aux moments indiqués, 104 cellules ont été ensemencées dans un milieu semi-solide à base de méthylcellulose en présence de cytokines humaines recombinantes : rh SCF, rh GM-CSF, rh G-CSF, rh Il-3, rh EPO, afin de favoriser une croissance optimale des progéniteurs érythroïdes (BFU-E et CFU-E) et des progéniteurs granulocytaires et macrophagiques (CFU-GM). BFU : unités formant des bourgeons ; CFU : unités formant des colonies. Une image typique des BFU-E et CFU-E est également présentée. Remarquez la couleur rouge-brun due à l'hémoglobinisation des BFU-E et CFU-E.

Graphiques de différenciation hématopoïétique montrant les marqueurs cellulaires CD34, CD36, CD71, GPA, benzidine et LDS au fil du temps.
Figure 5. Cinétique des marqueurs hématopoïétiques/érythroïdes au cours de la différenciation érythroïde ex vivo. Aux points temporels indiqués, 2x105 cellules ont été récoltées et analysées pour l'expression des marqueurs indiqués par cytométrie en flux (CD34, CD36, CD71, GPA et LDS) ou par microscopie (benzidine). Les barres représentent les pourcentages de cellules positives. CD34 : glycoprotéine transmembranaire, présente sur les cellules souches/progénitrices hématopoïétiques humaines ; CD36 : récepteur de la thrombospondine, présent sur les cellules progénitrices ; CD71 : récepteur de la transferrine, présent sur les progéniteurs érythroïdes et les réticulocytes ; GPA : glycophorine A, présente sur les précurseurs érythroïdes et les érythrocytes ; Benzidine : colorant de l'hémoglobine ; LDS : colorant laser styryl, colorant de l'ADN.

Chronologie de l'infection par le lentivirus shRNA, graphique en barres de l'expression de l'ARNm TAL1, microscopie GFP, cytométrie en flux.
Figure 6. Transfert génique médié par lentivirus dans des proérythroblastes primaires humains. (A) Chronologie de l'induction de l'extinction de TAL1 (KD) dans des proérythroblastes primaires à l'aide du système de transfert génique par lentivirus. (B) L'extinction de TAL1 a été réalisée par un shRNA anti-Tal1 délivré par lentivirus (TAL1 KD) ou par un shRNA contrôle désordonné (Scr). La cinétique du niveau de transcrit d'ARNm de TAL1 a été mesurée par RT-qPCR. Le transcrit de TAL1 est exprimé relativement à l'ARN 18S. (C) Le GFP délivré par lentivirus a été testé par microscopie (panneau gauche) ou par cytométrie en flux (panneau droit). 87 % des cellules étaient positives pour le GFP.

4. Matériaux

RéactifSourceNuméro de catalogue
RPMI 1640 SigmaR8758
Collagénase BRoche Applied Science11088807001
DNase ISigmaD5025-15KU
Filtres de pré-séparation (maille de nylon 30 μm)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
EasySep 10x Tampon de lyse des globules rougesStemCell Technologies20120
Kit de MicroBilles CD34Miltenyi Biotec Inc130-046-703
Colonnes LS Mini-MacsMiltenyi Biotec Inc130-042-401
Tampon de fonctionnement autoMACS – Tampon de séparation MACSMiltenyi Biotec Inc130-091-221
Séparateur MiniMACSMiltenyi Biotec Inc130-042-102
Cellules stromales de moelle osseuse de souris MS-5 (testées régulièrement pour la contamination par les mycoplasmes)DSMZACC 441
Solution de bleu de trypan (0,4 %)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
Tripsine 0,05 %/EDTAThermoScientific J101521
May Grunwald Giemsa Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
Essais Méthocult de formation de colonies par les cellules formant des colonies (CFC) pour cellules humaines StemCell Technologies 04044

Tableau 1.

ComposantSolution mèreVolume 600 ml
IMDMSigma I3390443,4 ml
Pénicilline/Streptomycine 1 % (vol/vol)Gibco 103786 ml
L-glutamine 4x10-3M200 mM (Gibco 25030)12 ml
Inositol 40 μg/ml4 mg/ml (Sigma I5125)
préparation : Dissoudre 28 mg de poudre dans 7 ml d'IMDM et filtrer pour stériliser ; stable pendant 1 semaine à 4 °C.		6 ml
Acide folique 10 μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
préparation : Dissoudre 7 mg de poudre dans 7 ml d'IMDM préalablement réchauffé et filtrer pour stériliser ; stable pendant 1 semaine à 4 °C. Réchauffer avant utilisation.		6 ml
Monothioglycérol 1,6x10-4M0,16 M (Sigma M6145)
préparation : Dissoudre 10 μl de solution mère 11,56 M dans 712 μl d'IMDM et filtrer pour stériliser ; stable pendant 1 semaine à 4 °C.		0,6 ml
Nitrate ferreux 90 ng/ml18 μg/ml (Sigma 8508)
préparation : Dissoudre 1,8 mg dans 1 ml d'eau distillée. Prélever 0,1 ml, ajouter 9,9 ml d'IMDM et filtrer pour stériliser ; stable pendant 1 semaine à 4 °C.		3 ml
Sulfate ferreux 900 ng/ml180 μg/ml (Sigma F8633)
préparation : Dissoudre 18 mg dans 1 ml d'eau distillée. Prélever 0,1 ml, ajouter 9,9 ml d'IMDM et filtrer pour stériliser ; stable pendant 1 semaine à 4 °C.		3 ml
Albumine sérique bovine-Insuline-Transferrine (BIT)
20 % (vol/vol)		StemCell Technologies 9500120 ml

Tableau 2.

ComposantSolution mèreVolume à ajouter à 100 ml de milieu IMDM supplémenté (tableau 2)
Hydrocortisone (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
préparation : Dissoudre 5 mg de poudre dans 1,03 ml d'IMDM. Prélever 0,1 ml, ajouter 9,9 ml d'IMDM et filtrer pour stériliser. Stable pendant 1 semaine à 4 °C.		1 ml
Facteur de cellules souches (SCF) 100 ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
préparation : Dissoudre 50 μg de poudre dans 500 μl de PBS + 0,1 % BSA et filtrer pour stériliser. Préparer des aliquotes de 100 μl et conserver à -20 °C.		100 μl
Érythropoïétine (EPO) 3 UI/ml100 μg/ml équivalent à 12 000 UI/ml (Feldan FB03-10-290)
préparation : Dissoudre 50 μg de poudre dans 500 ml de PBS + 0,1 % BSA et filtrer pour stériliser. Préparer des aliquotes de 25 ml et conserver à -20 °C.		25 μl
Interleukine 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
préparation : Dissoudre 10 μg de poudre dans 100 μl de PBS + 0,1 % BSA et filtrer pour stériliser. Préparer des aliquotes de 5 ml et conserver à -20 °C.		5 μl

Tableau 3.

RéactifSourceRéférence
Cellules 293T
(tester régulièrement la contamination par les mycoplasmes)		ATCCCRL-11268
DMEM/Glucose élevéThermoScientificSH30243.01
Bromure d'hexadiméthrine (Polybrene)SigmaH9268-5G
Tubes d'ultracentrifugation OptiSealBeckman Coulter361625
Plasmide psPAX2Addgene (laboratoire D. Trono)12260
Plasmide pMD2.GAddgene (laboratoire D. Trono)12259
Plasmide pBLOCK-it6-DEST (shTal1)Séquence d'ARNi anti-Tal1 clonée dans le plasmide pBLOCK-it6-DEST d'InvitrogenPalii et al. EMBO J.
Plasmide pBLOCK-it6-DEST (shScr)Séquence d'ARNi brouillée clonée dans le plasmide pBLOCK-it6-DEST d'InvitrogenPalii et al. EMBO J.
Plasmide pWPIAddgene (laboratoire D. Trono)12254

Tableau 4.

TamponPréparationConcentration finale
2xHBS
  • 1,6 g de NaCl
  • 1,3 g de HEPES
  • 0,04 g de Na2HPO4(7H2O)
  • Ajouter de l’eau Milli-Q.
  • Régler le pH à exactement 7,11-7,13 à l’aide de solution de NaOH et compléter avec de l’eau Milli-Q jusqu’à 100 ml.
  • Ajuster précisément le pH à 7,11-7,13.
  • Filtrer pour stériliser, préparer des aliquotes de 10 ml et conserver à -20 °C
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1,5 mM
CaCl2
  • 2,77 g de CaCl2 anhydre
  • Dissoudre dans 10 ml d’eau Milli-Q.
  • Filtrer pour stériliser, préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à -20 °C
  • 2,5 M
MS30
  • 25 ml de Tris [2 M] pH 8,0
  • 5 ml de EDTA [0,5 M]
  • 300 ml de glycérol
  • 50 mM
  • 2,5 mM
  • 30 % (v/v)

Tableau 5.

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Discussion

Un certain nombre de méthodes ont été utilisées précédemment pour différencier les cellules érythroïdes en culture avec des degrés variables de succès. Par exemple, certains protocoles sans co-culture sur MS-5 permet l'expansion des cellules érythroïdes, mais ne sont pas efficaces dans la production à pleine maturité globules rouges énucléés 12-17. Alors que d'autres méthodes permettant l'énucléation efficace, il est à la charge de la prolifération 18,19. La méthode que nous avons utili...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Nous remercions L. Douay et MC Giarratana (Université Paris VI, France) pour des conseils sur la différenciation érythroïde ex vivo, D. Allan et H. Atkins (IRSO, Canada) pour fournir des échantillons de sang (obtenues sous l'Hôpital d'Ottawa Research Ethics Board # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne) pour fournir les vecteurs lentiviraux et FJ Dilworth (IRSO, Canada) pour la lecture critique du manuscrit. Ce projet a été financé par une subvention des IRSC (MOP-82813) pour MBCGP est récipiendaire d'une recherche en Ontario Fonds Regulomics bourse de formation postdoctorale calcul. MB titulaire de la Chaire de recherche du Canada dans la régulation de l'expression génique.

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Références

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