Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo des cellules souches hématopoïétiques humaines

Résumé

Une Ex vivo Protocole de générer maturité des globules rouges humains à partir souches hématopoïétiques / progéniteurs est décrite. De plus, nous décrivons un système efficace de prestation de lentiviraux méthode pour knockdown l'TAL1 facteur de transcription dans les cellules érythroïdes primaires. L'efficacité de la livraison de gènes médiée lentivirus est démontré en utilisant des virus GFP exprimer.

Résumé

L'érythropoïèse est un système modèle couramment utilisé pour étudier la différenciation cellulaire. Pendant l'érythropoïèse, pluripotentes humain adulte des cellules souches hématopoïétiques (CSH) se différencient en progéniteurs oligopotent, précurseurs engagés et des globules rouges matures ^1. Ce processus est régi en grande partie au niveau de l'expression des gènes, par lequel les facteurs de transcription spécifiques d'activer des gènes spécifiques de lignée tout en réprimant de façon concomitante des gènes qui sont spécifiques à d'autres types cellulaires ^2. Les études sur les facteurs de transcription réglementant l'érythropoïèse sont souvent réalisées en utilisant des lignées cellulaires humaines et murines qui représentent, dans une certaine mesure, les cellules érythroïdes à des stades donnés de différenciation ^3-5. Cependant lignées cellulaires transformées ne peut que partiellement imitent les cellules érythroïdes et surtout ils ne permettent pas d'étudier les changements de manière compréhensible dynamiques qui se produisent que les progrès des cellules par de nombreuses étapes vers leur destin final érythroïdes. Par conséquent, un défi actuel reste le développement d'un protocole d'obtenir une population relativement homogène de CSH primaires et les cellules érythroïdes à différents stades de la différenciation dans des quantités qui sont suffisantes pour effectuer la génomique et la protéomique expériences.

Nous décrivons ici un protocole ex vivo de cellules de culture pour induire la différenciation érythroïde des humains hématopoïétiques cellules souches / progénitrices qui ont été isolées du sang de cordon soit, la moelle osseuse ou du sang périphérique adulte mobilisé par G-CSF (cytaphérèses). Ce système de culture, initialement développé par le laboratoire Douay ^6, utilise les cytokines et de co-culture de cellules mésenchymateuses d'imiter le microenvironnement médullaire. En utilisant ce protocole ex vivo la différenciation, on observe une forte amplification des progéniteurs érythroïdes, une induction de la différenciation exclusivement vers la lignée érythroïde et une maturation complète du stade de globules rouges énucléés. Ainsi, ce système fournit une occasion d'étudier le mécanisme moléculaire de régulation transcriptionnelle de cellules souches progresser sur la lignée érythroïde hématopoïétiques.

Etudier l'érythropoïèse au niveau transcriptionnel nécessite également la capacité de sur-exprimer ou knockdown facteurs spécifiques dans les cellules érythroïdes primaires. Pour ce faire, nous utilisons un système de lentivirus médiation du gène qui permet la livraison de l'infection efficace de diviser et de deux cellules ne se divisant ^7. Ici, nous montrons que nous sommes en mesure de l'efficacité knockdown TAL1 facteur de transcription dans les cellules érythroïdes primaires humains. En outre, l'expression de la GFP démontre une efficacité d'infection lentiviraux près de 90%. Ainsi, notre protocole fournit un système très utile pour la caractérisation du réseau de régulation des facteurs de transcription de contrôle qui l'érythropoïèse.

Protocole

Partie I. Érythropoïèse ex vivo des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques humaines

1. Isolement des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques humaines CD34⁺

La population de cellules CD34⁺ humaines, qui contient un mélange de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et de précurseurs précoces ⁸, est prélevée à partir de sang de cordon ombilical, de sang périphérique mobilisé avec du G-CSF (leucaphérèse) ou de moelle osseuse (Figure 1-Étape 1). Si vous utilisez du sang de cordon ou du sang périphérique, passez directement à l'étape 1.2. Si vous utilisez de la moe....

Discussion

Un certain nombre de méthodes ont été utilisées précédemment pour différencier les cellules érythroïdes en culture avec des degrés variables de succès. Par exemple, certains protocoles sans co-culture sur MS-5 permet l'expansion des cellules érythroïdes, mais ne sont pas efficaces dans la production à pleine maturité globules rouges énucléés ^12-17. Alors que d'autres méthodes permettant l'énucléation efficace, il est à la charge de la prolifération ^18,19. La méthode que nous avons utili.......