Transduction des cellules humaines avec des polymères complexés Lentivirus écotrope pour Enhanced biosécurité

Résumé

Les lentivirus sont un précieux outil de recherche pour explorer la fonction des gènes, mais les chercheurs peuvent souhaiter éviter la production de l'encodage des lentivirus pantropique connus ou soupçonnés oncogènes. Comme alternative, nous présentons un protocole de sécurité pour l'utilisation de lentivirus écotrope sur des cellules humaines modifiées pour exprimer des récepteurs mSlc7a1 écotrope.

Résumé

Des études souches et la biologie des cellules tumorales ont souvent besoin de transduction virale des cellules humaines avec des oncogènes connus ou suspectés, soulevant des questions de sécurité majeur pour le personnel de laboratoire. Lentivirus pantropique, comme le couramment utilisé VSV-G pseudotype, sont un outil précieux pour étudier la fonction des gènes, car ils peuvent transduire nombreux types cellulaires, y compris les cellules ne se divisent pas. Cependant, les chercheurs peuvent souhaiter éviter la production et la centrifugation de virus oncogènes pantropique encodage raison de la hausse des exigences de biosécurité de niveau et de manipulation des questions de sécurité. Plusieurs oncogènes puissants, y compris c-Myc et antigène T de SV40 grandes, sont connus pour augmenter la production de cellules souches pluripotentes induites (COPSi). Tous les autres connus iPSC induisant des modifications génétiques (Oct4, Sox2, KLF4, NANOG, LIN28, et la perte de fonction de p53) ont également des liens vers le cancer, les rendant de préoccupation de sécurité relativement élevé ainsi.

Bien que ces virus liés au cancer sont utiles dans l'étude de la reprogrammation cellulaire et de pluripotence, ils doivent être utilisés en toute sécurité. Pour répondre à ces questions de biosécurité, nous démontrons une méthode pour la transduction des cellules humaines avec des lentivirus écotrope, avec un accent supplémentaire sur un coût réduit et manipulation aisée. Nous avons produit des lentivirus écotrope avec titre suffisamment élevé pour transduire supérieure à 90% de cellules exprimant le récepteur humain exposé au virus, de valider l'efficacité de cette approche.

Lentivirus est souvent concentrés par ultracentrifugation; cependant, ce processus prend plusieurs heures et peuvent produire des aérosols infectieux à l'homme les chercheurs biomédicaux. Comme alternative, les particules virales peuvent être de manière plus sûre sur les cellules sédimentées par complexation avec le sulfate de chondroïtine et de polybrène (CS / PB). Cette technique augmente le titre fonctionnelle virale jusqu'à 3 fois dans des cellules exprimant de façon stable des récepteurs rétrovirus murin, avec le temps et le coût ajouté négligeables. La transduction des fibroblastes dermiques humains (HDFS) est améliorée en utilisant au maximum CS / PB concentrations d'environ 4 fois inférieure à la valeur optimale antérieurement pour des lignées cellulaires cancéreuses, ce qui suggère que la concentration du polymère doit être adaptée pour le type de cellules cibles d'intérêt. Nous avons donc décrire l'utilisation du bromure de tétrazolium-methylthiazolyldiphenyl (MTT) pour le dosage de la toxicité de polymère dans un type de cellules nouvelles. Nous observons la viabilité équivalent de HDFS après transduction virale en utilisant soit la complexation polymère ou la dose standard de polybrène (PB, 6 pg / ml), indiquant un minimum de toxicité aiguë.

Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de lentivirus écotrope de la surexpression d'oncogènes dans les cellules humaines, la réduction des risques de biosécurité et d'augmenter le taux de transduction. Nous démontrons également l'utilisation de polymères pour améliorer la complexation transduction tout en évitant les aérosols formant centrifugation des particules virales.

Protocole

1. Production, récolte et congélation du lentivirus

1. Consultez votre responsable de la sécurité institutionnelle avant de commencer ce protocole, et suivez les consignes de sécurité recommandées.
2. Jour 1. Commencez avec des cellules 293T saines et en croissance rapide pour produire le virus. Ensemencez les cellules à raison de 5 x 10⁶ cellules par plaque de 10 cm. Utilisez un milieu 293T sans antibiotique (DMEM à haute teneur en glucose contenant 10 % de FCS et 4 mM de L-glutamine) pour la production du virus.
3. Jour 2. En fin d'après-midi, transfectez les cellules 293T comme suit (les quantités indiquées correspondent à une plaque de 10 cm). Laissez tous les réactifs atteindre la température ambiante. Prélevez 375 μl d'OptiMEM dans un tube de microcentrifugeuse, puis ajoutez 25 μl de Fugene HD. Évitez tout contact du Fugene non dilué avec la paroi du tube.
4. Dans un tube de microcentrifugeuse, mélangez :
   • 5 μg de plasmide de transfert (Slc7a1, vecteur cible ou vecteur de contrôle fluorescent)
   • 3,75 μg de plasmide d'emballage (pCMV-dR8.91 ou psPax2)
   • 1,25 μg de plasmide d'enveloppe (pMD2.G pour pantropique, pHCMV-EcoEnv pour écotropique)
   • OptiMEM sans sérum jusqu'à un volume final de 100 μl
5. Combinez les contenus des deux tubes et incubez le mélange 20 à 30 minutes à température ambiante.
6. Remplacez le milieu des cellules 293T par 10 ml de milieu 293T frais sans antibiotique. Ajoutez goutte à goutte le mélange Fugene/plasmide sur la plaque et incubez toute la nuit à 37 °C, 5 % CO₂.
7. Jour 3. Remplacez le milieu des cellules 293T par 10 ml de milieu 293T frais sans antibiotique. Soyez délicat, car les cellules 293T adhèrent faiblement et peuvent se détacher si le milieu est pipeté trop brutalement sur la monocouche. Incubez pendant deux jours dans un incubateur humidifié pour la production du virus.
8. Jour 5. Récupérez le virus et filtrez-le à l’aide d’un filtre à faible liaison aux protéines de 0,45 mm. Utilisez-le immédiatement ou répartissez-le en aliquots à usage unique et congélez-les à -80 °C. Le titre du virus pantropique et écotropique doit être réévalué après un stockage de six mois et un mois, respectivement.
9. Effectuez le titrage du virus comme suit, en utilisant des cellules relativement sensibles à la transduction. Transduisez les cellules avec le virus de contrôle fluorescent pendant une nuit, en utilisant des dilutions sériées (par exemple 1:10, 1:100, 1:1000) dans du milieu frais contenant 6 μg/ml de PB. Le jour suivant, remplacez par du milieu frais. Laissez les cellules exprimer la protéine fluorescente pendant deux jours après la transduction, puis déterminez la fraction de cellules transduites par cytométrie en flux (FACS). Calculez le titre en unités transformantes (TU) par ml, en vous basant sur les dilutions donnant < 15 % de transduction afin de minimiser les événements de transduction multiples.
   

2. Transduction de cellules cibles humaines avec le récepteur de rétrovirus murin Slc7a1

1. Choisir une multiplicité d'infection (MOI) = 2 afin de garantir que la majorité des cellules seront transduites. Pour les cellules cibles résistantes à la transduction, comme les HDF, une MOI plus élevée sera nécessaire ; nous diluons le surnageant viral uniquement au 1:2 pour parvenir à transduire la majorité des cellules.
2. Transduire les cellules cibles pendant la nuit avec le surnageant viral dilué dans un milieu de culture frais contenant 6 μg/ml de PB, ce qui améliore la transduction en renforçant l'interaction électrostatique entre le virus et la cellule cible.¹ Idéalement, on devrait utiliser un volume minimal de virus, par exemple 1 ml pour une plaque de 35 mm, car la diffusion constitue un facteur limitant pour l'efficacité de la transduction.
3. Cultiver les cellules pendant au moins 48 heures après avoir retiré le virus avant de les transduire avec un virus écotrope, afin de s'assurer d'une expression suffisante du récepteur Slc7a1.
4. (Facultatif) Il est possible d'utiliser la blasticidine pour sélectionner les cellules stables transduites exprimant Slc7a1, si souhaité. Une courbe de mort à la blasticidine doit être établie préalablement afin de déterminer la concentration efficace minimale, généralement comprise entre 2 et 10 μg/ml, qui tue toutes les cellules cibles non transduites en 7 jours. Environ 2 jours après le retrait du virus Slc7a1, passer les cellules transduites à un milieu contenant de la blasticidine. Cultiver les cellules dans un milieu contenant de la blasticidine pendant 7 jours, au terme desquels toutes les cellules restantes exprimeront de façon stable le récepteur du rétrovirus et pourront alors être transduites avec un virus écotrope, ainsi que conservées pour une utilisation ultérieure sous forme d'une lignée stable exprimant Slc7a1.

3. Titrage du complexe polymère pour déterminer la toxicité

1. Jour 1. Ensemencer les cellules à raison de 5000 cellules/puits dans une plaque 96 puits, en prévoyant au moins trois puits par groupe expérimental. Inclure des cellules non transduites dans un milieu complet afin d'obtenir une valeur de référence pour des cellules saines, ainsi que des échantillons de cellules dans un milieu sans sérum pour induire un arrêt de croissance servant de contrôle. Parallèlement, ensemencer des cellules dans un format approprié (par exemple, une plaque 24 puits) pour l'analyse microscopique ou par cytométrie en flux (FACS) de l'efficacité de transduction dans chaque condition expérimentale.
2. Jour 2. Transduire les cellules dans les plaques préparées pour les analyses MTT et FACS avec un virus codant pour la GFP, à une MOI de 0,5 afin de transduire environ 40 % des cellules cibles. Tester différentes concentrations de CS/PB (par exemple, 50, 100, 200, 400, 600 et 800 mg/ml de chaque composant), ainsi que 6 μg/ml de PB, afin de déterminer les concentrations optimales. Préparer les complexes polymériques comme décrit dans la partie 4 ci-dessous.
3. Jour 3. Retirer le milieu contenant le virus et le remplacer par du milieu frais. Remettre les plaques dans un incubateur humidifié.
4. Jour 5. Analyser la plaque FACS pour déterminer l'efficacité de transduction à chaque concentration polymérique.
5. Jour 6. Retirer le milieu de tous les puits de la plaque MTT et les remplacer par 100 μl de solution MTT (1 mg/ml de MTT dans un milieu complet). Incuber pendant trois heures dans un incubateur humidifié afin de permettre la réduction du MTT dans les mitochondries des cellules métaboliquement actives.
6. Retirer la solution MTT et ajouter 200 μl de solvant MTT (0,1 N HCl, 0,1 % Igepal CA-630 dans l'isopropanol).
7. Incuber pendant deux heures à température ambiante ou jusqu'à dissolution complète du précipité violet de formazan MTT. Mesurer l'absorbance sur un lecteur de microplaque à 570 nm, en soustrayant la valeur du fond mesurée à 690 nm.
8. Sélectionner la concentration polymérique optimale produisant un accroissement maximal de la transduction, tel que déterminé par la FACS, avec un effet minimal sur l'activité métabolique, tel que déterminé par le test MTT. Pour les HDF, nous avons sélectionné 100 μg/ml de CS/PB sur la base des données présentées dans les résultats représentatifs ci-dessous.

4. Transduction écotrope avec complexation par polymère

1. Préparer des solutions mères stériles filtrées de PB et de sulfate de chondroïtine à 20 mg/ml dans de l'eau. Répartir en aliquotes et conserver à -20°C.
2. Prélever le surnageant viral dans un tube de microcentrifugeuse et diluer à la concentration finale souhaitée (par exemple, une MOI de 2) avec du milieu de culture frais. Ajouter successivement des volumes égaux de PB et de sulfate de chondroïtine (concentrations déterminées à l'étape 3 ci-dessus), en agitant légèrement le tube après chaque ajout pour homogénéiser. Le mélange viral devient immédiatement trouble avec la formation de précipités. Incuber le mélange viral à température ambiante pendant 5 minutes pour permettre la formation des complexes.
3. Retirer le milieu des cellules cibles exprimant le récepteur, les remplacer par le mélange viral et incuber toute la nuit à 37°C, 5 % CO2. Après avoir retiré le mélange viral, laver la surface des cellules deux fois avec du PBS afin d'éliminer les complexes viraux. Une élimination complète n'est pas nécessaire ; nous n'avons observé aucun effet néfaste sur la viabilité cellulaire lié à la présence de complexes polymériques résiduels.

5. Vérification de la spécificité de la transduction écotrope

1. Lorsque vous produisez pour la première fois un virus écotropic, il est prudent, pour des raisons de sécurité, de vérifier que le virus est incapable de transduire des cellules humaines non modifiées. Transduisez des cellules humaines avec un lentivirus écotropic à concentration relativement élevée (une dilution d’un facteur 1 à 2 du surnageant viral dans un milieu frais) pendant une nuit en présence de 6 μg/ml de PB ou d’une concentration optimisée de CS/PB.
2. Éliminez le milieu contenant le virus et remplacez-le par du milieu frais. Après avoir incubé les cellules pendant 2 jours, validez l’expression du transgène par cytométrie en flux (FACS) en utilisant des vecteurs fluorescents et/ou par RT-PCR avec des amorces spécifiques du transgène.

6. Résultats représentatifs :

La figure 1A illustre le processus de production de lentivirus, et la figure 1B montre la transduction de cellules humaines avec un lentivirus écotrope, incluant une pré-transduction avec le récepteur rétroviral murin Slc7a1. Pour le titrage du virus, nous utilisons une lignée cellulaire humaine de rhabdomyosarcome transduite de façon stable avec Slc7a1 (Slc-hRMS). Lorsque nous utilisons des vecteurs témoins fluorescents pour surveiller l'efficacité de la transduction, nous obtenons couramment une efficacité de transduction > à 90 % des cellules Slc-hRMS avec le virus écotrope, comme illustré aux figures 2A et 2B. Les taux de transduction des HDF sont généralement plus faibles car les cellules n'ont pas été sélectionnées au blasticidin pour l'expression du récepteur (figure 2C). Les titres du lentivirus écotrope sont généralement de 10 à 20 % de ceux du virus pseudotypé avec VSV lorsqu'ils sont mesurés sur les cellules Slc-hRMS (figure 2D).

Un cycle de congélation-décongélation réduit le titre du virus écotrope de 16 à 3 %, ce qui équivaut à la perte de titre observée lors d'un cycle unique de congélation-décongélation du virus pseudotypé avec VSV (p > 0,05). Contrairement à des rapports antérieurs,² nous n'observons aucun effet positif sur le titre viral d'une congélation rapide dans de la glace sèche. Au contraire, nous obtenons des titres post-décongélation plus élevés pour l'un ou l'autre pseudotype en plaçant simplement les tubes contenant le virus dans un congélateur à -80 °C (données non montrées).

Le test de viabilité au MTT permet une détection sensible de l'arrêt de la croissance dans les cellules cibles. La transduction avec le virus ainsi que des concentrations de CS/PB allant jusqu'à 800 μg/ml n'a aucun effet sur le métabolisme des HDF (Fig. 3A). L'exposition au CS/PB sans virus n'a également aucun effet toxique sur les cellules (données non montrées). L'analyse FACS des HDF transduits avec le virus et diverses concentrations de CS/PB montre une amélioration de la transduction par rapport au PB seul (Fig. 3B). L'amélioration maximale est observée à 100 μg/ml de CS/PB (Fig. 3C), soit plusieurs fois inférieure aux valeurs précédemment rapportées.³ Il est donc important d'optimiser les conditions pour chaque type de cellule cible.

La complexation avec CS/PB augmente d'environ trois fois le titre observé dans le Slc-hRMS (Fig. 4A, p < 0,01). En pratique, cet effet est plus marqué sur l'efficacité de transduction à de faibles concentrations de virus qu'à des concentrations plus élevées (Fig. 4B), ce qui est très probablement dû à la présence de cellules transduites de manière multiple et à la saturation des récepteurs à fortes concentrations de virus.

La transduction par un virus écotrope est spécifique aux cellules exprimant le récepteur du rétrovirus murin. Lors de la transduction de cellules humaines non modifiées par un virus écotrope, nous n'avons observé aucune fluorescence supérieure au fond de l'absence de transduction, qu'on utilise du PB ou du CS/PB, comme illustré à la figure 5A. Au microscope, les HDF ne montrent aucune transduction en l'absence de récepteur (fig. 5B), tandis que la pré-transduction avec le récept游戏副本

Figure 1. Vue schématique (A) du processus de production du virus et (B) de la transduction de cellules humaines exprimant le récepteur rétroviral murin suivi d'un lentivirus écotrope.

Figure 2. Transduction hautement efficace de cellules humaines avec un lentivirus écotrope codant pour la GFP. Les cellules ont été pré-transduites avec le récepteur rétroviral murin Slc7a1. (A) Ligne cellulaire de rhabdomyosarcome humain sélectionnée à la blasticidine pour Slc7a1 (Slc-hRMS), transduite (bleu) ou non transduite (rose) avec la GFP. (B) Micrographie en fluorescence de cellules Slc-hRMS transduites de façon écotrope (4X). (C) Fibroblastes dermiques humains transduits (bleu) et non transduits (rose) avec un lentivirus écotrope codant pour la GFP ; les cellules ont été transduites avec Slc7a1 deux jours avant la transduction écotrope. (D) Titre du lentivirus pseudotypé VSV-G et du lentivirus écotrope, mesuré sur les cellules Slc-hRMS.

Figure 3. Optimisation des concentrations de sulfate de chondroïtine/polybrene (CS/PB) dans les fibroblastes dermiques humains. (A) Viabilité des HDF mesurée par le test MTT après transduction en présence de PB seul ou de différentes concentrations de CS/PB. (B) Amélioration de l'efficacité de transduction dans les HDF par différentes concentrations de CS/PB, mesurée par cytométrie en flux (FACS). (C) Quantification de l'amélioration de la transduction, montrant que la transduction maximale est obtenue à 100 μg/ml de CS/PB.

Figure 4. Effet de 400 μg/ml de CS/PB sur la transduction de Slc-hRMS par un lentivirus écotrope. (A) Amélioration du titre, et (B) augmentation du taux de transduction par rapport à 6 μg/ml de polybrene seul.

Figure 5. Absence de transduction écotrope des HDF en l'absence du récepteur viral rétroviral murin Slc7a1. (A) Graphique FACS de fibroblastes humains BJ, non transduits (rose) ou transduits (bleu) avec un lentivirus GFP écotrope, dans les deux cas en absence du récepteur Slc7a1. Fibroblastes humains BJ transduits avec un lentivirus GFP écotrope, sans (B) et avec (C) pré-transduction du récepteur Slc7a1 (4X).

Discussion

Recombinant GAMMARETROVIRUS écotrope à base de virus leucémie murine de Moloney (MLV) et ses récepteurs mSlc7a1 sont bien étudiés et largement disponible, ayant été utilisé pendant plus de 20 ans pour fournir des transgènes dans les cellules murines. GAMMARETROVIRUS écotrope a aussi été utilisée plus récemment pour offrir oncogènes dans les cellules humaines;. Dans le contexte de la reprogrammation cellulaire, l'utilisation de mSlc7a1 pour éviter la production de virus oncogènes humains amphotropes hébergement est bien établi ^4,5 Cependant, lentivirus fournit des avantages significatifs sur GAMMARETROVIRUS dans la transduction de populations de cellules réfractaires, y compris les ⁶ cellules primaires qui sont souvent la cible souhaitable pour la reprogrammation, parce que les lentivirus de pré-intégration complexe permet la transduction des cellules ne se divisant ^7.

Les lentivirus ont été produites avec des dizaines de pseudotypes différents, y compris les MLV, dans un effort pour modifier le tropisme du virus, la toxicité et d'autres propriétés. ⁸ lentivirus écotrope MLV pseudotypé a été utilisé pour transduire des cellules de souris, ^9, mais a rarement été utilisée sur des cellules humaines ^10. Nous proposons donc l'utilisation de MLV-pseudotypées lentivirus écotrope comme un véhicule sûr, rentable et très efficace pour livrer des oncogènes connus ou présumés, y compris les facteurs cellulaires reprogrammation, pour les cellules humaines.

Il est essentiel de noter que ce protocole n'est pas entièrement éliminer le besoin de produire et d'utiliser des lentivirus pantropique, mais plutôt ce protocole sépare l'oncogène (s) du virus de la pantropique, isolation des chercheurs de potentiel d'auto-inoculation avec des virus liés au cancer. Le mSlc7a1 protéine et son homologue humain sont hSlc7a1 exprimée de manière ubiquitaire transporteurs d'acides aminés avec aucune tumorigénicité connus ou capacité à conférer un avantage de croissance sélective sur les cellules réceptrices, ¹¹ mSlc7a1 prise de risque relativement faible pour l'incorporation dans virus amphotrope. Cette étape ajoutée peut être particulièrement utile dans les laboratoires manquent de virus dédiés ou des installations de culture tissulaire du niveau requis de biosécurité.

Dans certaines situations, il peut être possible d'éliminer complètement l'utilisation de virus pantropique en transfectant le plasmide Slc7a1 directement dans les cellules cibles, mais de nombreuses cellules qui seraient des cibles utiles de cette technique sont aussi réfractaires à la transfection. Comme alternative, la possibilité d'isoler les cellules transduites-Slc7a1 par sélection blasticidine signifie que VSV-G lentivirus pseudotypées peut être utilisée qu'une fois pour générer un stock de cellules exprimant le récepteur, après quoi le virus écotrope peut être utilisée en routine pour la transduction de ces cellules pour de nombreux expériences. Les chercheurs devraient toujours suivre leurs directives de sécurité institutionnel pour travailler avec toute lentivirus, quel que soit son tropisme.

Les titres de virus écotrope obtenus avec ce protocole sont modérément plus faible que le virus VSV-pseudotypées, généralement à 10-20% du titre du virus pantropique, en accord avec les études précédentes. ⁹ Ces titres ont été mesurés dans les cellules humaines transduites avec Slc7a1 stablement, de sorte que le plus faible titre observé pour le virus écotrope peut être en partie due à l'expression variée du gène du récepteur dans les cellules cibles. Néanmoins, les titres viraux obtenus dans notre protocole sont plus que suffisantes pour la plupart des applications et conduire à la transduction de la majorité des cellules, dans certains cas> 90% des cellules.

Centrifugation basé techniques sont couramment utilisées pour concentrer les particules virales. Toutefois, la centrifugation nécessite plusieurs heures, génère des aérosols infectieux, et peut entraîner une perte importante de particules virales. ¹² Comme alternative, la complexation avec CS / PB peut être utilisé pour améliorer la transduction sans altérer le tropisme viral. ³ Cette méthode est rapide (5 minutes ) et peu coûteux (0,03 $ par tranche de 10 virus ml), tandis qu'environ tripler le titre observé. Aucun équipement spécial ou de réactifs de propriété sont nécessaires, et nous avons observé un minimum de toxicité aiguë après exposition des HDFS à CS / PB, en accord avec des travaux antérieurs dans d'autres lignées cellulaires. ¹³ Un inconvénient potentiel de ce protocole est que certains complexes visibles au microscope polymères adhèrent à les cellules pendant plusieurs jours dans la culture. Nous ne pouvons pas exclure la possibilité que ces complexes, tout en n'étant pas manifestement toxiques pour les cellules, peuvent avoir des effets plus subtils sur les processus cellulaires.

Ici, nous avons décrit une méthodologie pour sûr et efficace de transduction des cellules humaines avec des facteurs oncogènes. Cette approche devrait être d'une grande utilité pour les chercheurs qui étudient les oncogènes et biologie des cellules souches, y compris les cellules iPS.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Murin MLV récepteurs
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G enveloppe
pCMV-dR8.91	D. Trono de laboratoire 14		Emballage plasmidique (équivalent psPax2 plasmide est disponible à partir Addgene, Cat. Numéro 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Enveloppe écotrope
FUGW	Addgene	14883	GFP plasmide de contrôle
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadiméthrine bromure (Polybrène)	Sigma-Aldrich	H9268
Le sel de chondroïtine sulfate de sodium à partir de cartilage de requin	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidine S	Fisher	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tétrazolium (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021