Outils d’édition de base médiés par CRISPR : une technique d’édition du génome pour induire une substitution de base ciblée

Résumé

Source : Voir, J. E., et al. Évaluation fonctionnelle des variants BRCA1 à l’aide d’éditeurs de base médiés par CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo explique le concept des éditeurs de bases de cytosine médiés par CRISPR pour induire une substitution nucléotidique ciblée.

Protocole

1. Création de variantes BRCA1 à l’aide d’outils d’édition de base médiés par CRISPR

REMARQUE : Si les lignées cellulaires HAP1-BE3 ne sont pas utilisées, l’ADN plasmidique codant pour BE3 peut être co-transfecté avec l’ARNg ciblant BRCA1. Par rapport à la co-transfection des plasmides BE3 et de l’ARNg, la transfection du plasmide de l’ARNg vers les cellules HAP-BE3 induit une édition de base efficace jusqu’à 3 fois au locus cible dans nos mains.

1. Grainez 5 x 10⁵ cellules HAP1-BE3 (ou cellules HAP1 dans le cas de méthodes de co-transfection) par puits dans des plaques de 24 puits 1 jour avant la transfection. Au moment de la transfection, cultiver les cellules pour atteindre une densité appropriée (70 % à 80 % de confluence).
2. Transfectez les ARNg ciblant BRCA1 à l’aide des réactifs de transfection achetés (table des matériaux) conformément au protocole du fabricant. Utilisez 1 μg d’ARNg ciblant BRCA1 (avec 1 μg d’ADN plasmidique codant pour BE3 dans le cas de méthodes de co-transfection) pour induire la conversion C :G en T :A aux sites cibles BRCA1. Incuber les cellules à 37 °C et les faire sous-cultiver tous les 3 à 4 jours.
3. Récoltez les pastilles cellulaires 3, 10 et 24 jours après la transfection pour analyser l’efficacité de l’édition de base (les échantillons de 3 jours après la transfection sont analysés en tant qu’échantillons du jour 0).
4. Extraire l’ADN génomique à l’aide du kit de purification de l’ADN génomique (Table des matériaux).
   REMARQUE : Nous recommandons d’optimiser les conditions de transfection avec un rapport variable entre le réactif et l’ADN. La condition optimale pour la transfection de HAP1 est un rapport réactif/ADN de 4:1 dans nos mains.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027	Réactif de transfection
Opti-MEM	Gibco	31985070	Matériaux de transfection
Réactif de transfection FuGENE HD	Promega	E2311	Réactif de transfection
médium Dulbecco modifié d’Iscove	Gibco	12440046	Milieu pour cellules HAP1
lentiCas9-Blast	Addgene	Référence 52962	ADN plasmidique pour le clonage de lentiBE3
Kit de sang et de tissus DNeasy	Qiagen	Référence 69504	Kit de préparation de l’ADN génomique

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