Outils d’édition de base médiés par CRISPR : une technique d’édition du génome pour induire une substitution de base ciblée

1. Création de variantes BRCA1 à l’aide d’outils d’édition de base médiés par CRISPR

REMARQUE : Si les lignées cellulaires HAP1-BE3 ne sont pas utilisées, l’ADN plasmidique codant pour BE3 peut être co-transfecté avec l’ARNg ciblant BRCA1. Par rapport à la co-transfection des plasmides BE3 et de l’ARNg, la transfection du plasmide de l’ARNg vers les cellules HAP-BE3 induit une édition de base efficace jusqu’à 3 fois au locus cible dans nos mains.

1. Grainez 5 x 10⁵ cellules HAP1-BE3 (ou cellules HAP1 dans le cas de méthodes de co-transfection) par puits dans des plaques de 24 puits 1 jour avant la transfection. Au moment de la transfection, cultiver les cellules pour atteindre une densité appropriée (70 % à 80 % de confluence).
2. Transfectez les ARNg ciblant BRCA1 à l’aide des réactifs de transfection achetés (table des matériaux) conformément au protocole du fabricant. Utilisez 1 μg d’ARNg ciblant BRCA1 (avec 1 μg d’ADN plasmidique codant pour BE3 dans le cas de méthodes de co-transfection) pour induire la conversion C :G en T :A aux sites cibles BRCA1. Incuber les cellules à 37 °C et les faire sous-cultiver tous les 3 à 4 jours.
3. Récoltez les pastilles cellulaires 3, 10 et 24 jours après la transfection pour analyser l’efficacité de l’édition de base (les échantillons de 3 jours après la transfection sont analysés en tant qu’échantillons du jour 0).
4. Extraire l’ADN génomique à l’aide du kit de purification de l’ADN génomique (Table des matériaux).
   REMARQUE : Nous recommandons d’optimiser les conditions de transfection avec un rapport variable entre le réactif et l’ADN. La condition optimale pour la transfection de HAP1 est un rapport réactif/ADN de 4:1 dans nos mains.