Micro-injection de cellules robotisées guidée par l’image : une technique automatisée à haut débit pour l’administration précise de polysaccharides marqués par fluorescence dans des cellules neuronales uniques dans des cultures de coupes cérébrales organotypiques

Résumé

Source : Shull, G. et al. Manipulation de cellules souches neurales uniques et de neurones dans des tranches de cerveau à l’aide de la micro-injection robotisée. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous démontrons la micro-injection robotique de polysaccharides marqués par fluorescence dans des neurones pyramidaux dans des tranches organotypiques de cerveau embryonnaire de souris à l’aide d’un auto-injecteur. L’auto-injecteur est une plate-forme robotique qui utilise des images acquises à partir d’un microscope pour l’administration précise de biomolécules d’intérêt dans des cellules uniques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Installation du logiciel

1. Suivez les instructions pour installer le logiciel à partir de https://github.com/bsbrl/Autoinjector.

2. Préparation des réactifs et des pipettes

1. Agarose : Préparez de l’agarose à 3 % en dissolvant séparément 3 g d’agarose à large gamme et 3 g d’agarose à bas point de fusion dans 100 ml de PBS de qualité culture cellulaire dans deux flacons en verre distincts de 200 ml, respectivement. Conserver à température ambiante jusqu’à 3 mois.
2. Solution de Tyrode : Dissoudre 1 g de bicarbonate de sodium et de sel de Tyrode (utiliser le contenu de la bouteille entière) et 13 ml de 1 M de HEPES dans 1 L d’eau distillée. Ajustez le pH à 7,4. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 μm sur la bouteille.
3. Milieu de culture en tranches (SCM) : Ajouter 10 mL de sérum de rat, 1 mL de 2 mM de glutamine, 1 mL de pénicilline-streptomycine (100x), 1 mL de supplément N-2 (100x), 2 mL de supplément B27 (50x) et 1 mL de tampon HEPES (pH 7,3) dans 84 mL de milieu neurobasal. Aliquote 5 mL de SCM dans des tubes de 15 mL. Conserver à -20 °C.
4. Milieu de micro-injection indépendant du CO₂ (CIMM) : Préparez 5 solutions modifiées à faible teneur en glucose DMEM (sans rouge de phénol) en dissolvant la poudre dans 200 ml d’eau distillée. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 μm (pour la poudre DMEM, utilisez le contenu de la bouteille entière). Pour préparer 100 mL de CIMM, mélanger 20 mL de solution modifiée 5x DMEM, 1 mL de tampon HEPES, 1 mL de supplément N2 (100x), 2 mL de supplément B27 (50x), 1 mL de pénicilline-streptomycine (100x), 1 mL de 2 mM de glutamine et 74 mL d’eau distillée. Conserver la solution à 4 °C.
5. Tampon de reconstitution : Préparez le tampon de reconstitution en dissolvant 262 mM de NaHCO₃, 0,05 N NaOH, 200 mM d’HEPES dans de l’eau distillée. Stérilisez la solution par filtration à travers un système de filtre de 0,22 μm dans une bouteille en verre stérile. Aliquote 500 μL de tampon de reconstitution dans des tubes de microcentrifugation hermétiques. Conserver à 4 °C.
6. Colorant par micro-injection : Dissoudre le dextran marqué par fluorescence dans de l’eau distillée exempte de RNase (concentration finale 10 μg/μL). Préparez des aliquotes de 5 μL et conservez-les à -20 °C jusqu’à utilisation.
7. Tirez les pipettes de micro-injection des capillaires en verre borosilicaté (1,2 mm de diamètre extérieur, 0,94 mm de diamètre intérieur) à l’aide de l’extracteur de micropipettes. Protégez les pipettes de la poussière. Ne conservez pas les pipettes pendant plus de 2 à 3 jours. Pour cette expérience, les paramètres de traction étaient HEAT : température de la rampe +1 – 5 ; TRACTION : 100 ; VEL : 110 ; DEL : 100. HEAT et VEL sont les paramètres qui affectent le plus la forme et la taille de la pipette.
   note: La pipette de micro-injection optimale a une pointe longue et flexible, pour éviter d’endommager les cellules lors de la micro-injection.

3. Préparation de la tranche de tissu

1. Faites fondre l’agarose à 3 % à l’aide d’un four à micro-ondes avant la dissection du tissu cérébral. Ne laissez pas l’agarose se solidifier en la maintenant dans un bain-marie à 37 °C avant de l’encastrer. Assurez-vous que les pipettes sont à l’abri de la poussière. Ne conservez pas les pipettes pendant plus de 2 à 3 jours.
2. Décongeler une aliquote de SCM et réchauffer 10 à 12 mL de CIMM et 20 mL de solution de Tyrode à 37 °C à l’aide d’un bain-marie.
3. Mélanger le traceur fluorescent (Dextran-3000 ou Dextran-10000-Alexa conjugué ; concentration finale 5–10 μg/μL) avec le(s) autre(s) produit(s) chimique(s) à injecter. Centrifuger la solution de microinjection à 16 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Recueillir le surnageant et le transférer dans un nouveau tube. Conservez la solution de microinjection sur de la glace jusqu’à utilisation.
4. Utilisez les têtes d’embryons de souris E13.5 à E16.5 pour préparer des coupes de tissu organotypique du télencéphale. Retirez la peau et ouvrez le crâne à l’aide de la pince, en vous déplaçant le long de la ligne médiane. Disséquez le cerveau embryonnaire du crâne ouvert et retirez les méninges recouvrant le tissu cérébral en commençant par la face ventrale du cerveau. Laissez le cerveau entier disséqué dans la solution de Tyrode sur un bloc chauffant à 37 °C.
   note: Toutes les étapes de dissection décrites au point 3.4 doivent être effectuées dans une solution de Tyrode préchauffée.
5. Versez l’agarose fondue à large gamme dans un moule d’enrobage jetable. Lorsque l’agarose est refroidie à 38-39 °C, transférez-y soigneusement les cerveaux (4 au maximum) à l’aide d’une pipette Pasteur. Utilisez toujours des pointes de coupe pour cette étape.
6. Remuez l’agarose autour du tissu à l’aide d’une spatule ou d’une paire de pinces Dumont #1 sans toucher le tissu. Laissez l’agarose se solidifier à température ambiante. Une fois que l’agarose s’est solidifiée, coupez l’excès d’agarose entourant le tissu.
7. Remplissez le bac tampon avec du PBS. Orientez le cerveau avec l’axe rostro-caudal du tissu perpendiculaire au plateau (utilisez comme repère les bulbes olfactifs, représentant la partie la plus rostrale du cerveau). Coupez des tranches de 250 μm à l’aide d’un vibratome.
8. Remplissez une boîte de Pétri de 3,5 cm avec 2 ml de milieu préchauffé. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, transférez les tranches (10 à 15) dans ce plat. Une fois cela fait, déplacez la boîte de Pétri avec les tranches dans l’incubateur de culture de tranches. Maintenir les tranches à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 40 % O₂ / 5 % CO₂ / 55 % N₂ jusqu’à utilisation.

4. Micro-injection

1. Allumez l’ordinateur, le microscope, la caméra du microscope, les manipulateurs, le dispositif de pression et le capteur de pression. Chargez l’application en cliquant sur le fichier « launchapp.py » dans le dossier principal téléchargé depuis GitHub et spécifiez les paramètres de l’appareil dans l’écran contextuel (voir l’étape 1.1 pour les instructions d’installation).
2. Créez une pression vers l’extérieur pour éviter un colmatage indésirable avant d’immerger la pipette dans la solution. Pour appliquer une pression sur la pipette, faites glisser la barre de pression de compensation à 24-45 % et cliquez sur Définir les valeurs. Ensuite, réglez la pression à une pression suffisante en tournant le bouton de la soupape de pression mécanique sur 1 à 2 PSI (69 à 138 mbar) comme indiqué par le capteur de pression.
3. Transférer les tranches dans une boîte de Pétri de 3,5 cm contenant 2 ml de CIMM préchauffé. Placez les tranches à micro-injecter au centre de la boîte de Pétri. Transférez la boîte de Pétri dans l’étage de micro-injection préchauffé (37 °C).
4. Chargez la pipette de micro-injection avec 1,4 à 1,6 μL de solution micro-injectée (à partir de l’étape 3.3) à l’aide d’une pipette en plastique à pointe longue. Insérez la pipette de micro-injection dans le support de pipette.
5. En utilisant le grossissement le plus faible du microscope, faites la mise au point sur la tranche et guidez la micropipette vers ce champ de vision (FOV) afin qu’elle soit focalisée sur le même plan que la cible de la tranche. Basculez la sortie du microscope sur la caméra pour voir le FOV dans l’application.
6. Cliquez sur le bouton d’agrandissement en haut à gauche de l’interface pour lancer l’étalonnage de l’appareil. Une fenêtre vous demandera de sélectionner l’agrandissement. Sélectionnez le grossissement 10x ou le grossissement sur lequel l’objectif est réglé (par exemple, 4x, 10x, 20x, 40x) et appuyez sur OK. Le logiciel suppose que l’objectif interne est de 10x (le grossissement le plus courant).
7. Refocalisez la pointe de la pipette à l’aide de la roue micrométrique du microscope et cliquez sur la pointe de la pipette avec le curseur. Ensuite, appuyez sur le bouton étape 1.1 et appuyez sur OK dans la fenêtre contextuelle. La pipette se déplacera dans la direction Y. Cliquez sur l’extrémité de la pipette et appuyez sur le bouton Step 1.2. Enfin, entrez 45 dans la case Angle de la pipette et appuyez sur la touche Définir l’angle.
8. Entrez les paramètres souhaités dans le panneau de commandes de micro-injection automatisée. Pour la micro-injection dans les progéniteurs apicals, réglez la distance d’injection à 20-40 μm et la profondeur à 10-15 μm. Pour la micro-injection dans les neurones, réglez la distance d’injection de 30 à 40 μm du côté basal et la profondeur de 10 à 30 μm selon ce qui est ciblé. Réglez toujours la vitesse sur 100 %. Cliquez sur Définir les valeurs.
   note: La distance d’approche est la distance à laquelle la pipette se retire du tissu avant de passer à la distance d’injection suivante, la profondeur est la profondeur dans le tissu de la micro-injection, l’espacement est la distance le long de la ligne entre les injections séquentielles, la vitesse est la vitesse de la pipette en μm/s.
9. Cliquez sur le bouton Dessiner l’arête et faites glisser le curseur le long de la trajectoire souhaitée dans la fenêtre contextuelle pour définir la trajectoire d’injection. Pour la micro-injection de cellules souches progénitrices, la face ventrale de la surface du télencéphale est ciblée. Amenez la pipette au début de la ligne et cliquez sur la pointe de la pipette. Cliquez sur Trajectoire d’exécution pour commencer la micro-injection. Répétez cette étape pour chaque plan d’injection ciblé (généralement pour 3 à 4 plans avec 40 à 75 injections par plan).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Produits chimiques
Agarose, à faible point de fusion	Carl Roth	Réf.# 6351.2
Agarose, Aire de répartition sauvage	Sigma-Aldrich	N° de catalogue # A2790
Best-CA 221 Colle	Best Klebstoffe GmbH & Co.KG	Cat# CA221-10ml
B-27 Supplément	Thermo Fisher Scientific	Cat# 17504044
eau distillée
DMEM-F12, indépendant du CO2 (sans rouge de phénol)	Sigma-Aldrich	N° de catalogue : D2906
DMEM-F12, indépendant du CO2 (avec rouge de phénol)	Sigma-Aldrich	Réf. # D8900
HEPES-NAOH, pH 7,2, 1M (tampon HEPES)	Carl Roth	Cat# 9105.3
L-Glutamine, 200 mM	Thermo Fisher Sientific	Cat# 25030024
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	Réf. # 81381
N-2 Supplément	Thermo Fisher Scientific	Cat# 17502048
Milieu neurobasal	Thermo Fisher Scientific	Cat# 21103049
Eau sans nucléases	Thermo Fisher Scientific	N° de catalogue : AM9937
O2 (40 %), CO2 (5 %), N2 (55 %) Mélange, 50 litres
Pbs
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15140122
Sérum de rat	Laboratoires Charles River
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Merck	N° de catalogue # 106323
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Merck	Cat# 106482
Le sel de Tyrode	sigma	N° de catalogue (N° T2145-10x1L)
équipement
Capillaires en verre borosilicaté, diamètre extérieur de 1,2 mm x diamètre intérieur de 0,94 mm	Instruments Sutter	N° de catalogue # BF-120-94-10
Système de filtration par le dessus de la bouteille, 500 mL	Corning	Cat# 430769
PC ordinateur
Banc de pression personnalisé		Banc de pression personnalisé
Régulateur de pression électronique	Parker Hannifin	N° de catalogue : 990-005101-002
Tubes Falcon, 15 mL	Corning	N° de catalogue # 430791
Tubes Falcon, 50 mL	Corning	Cat# 430829
Extracteur de micropipette flamboyant/ marron	Instruments Sutter	N° de catalogue # P-97
Forceps, Dumont n° 3	Outils scientifiques fins	Réf. # 11231-30
Forceps, Dumont n° 5	Outils scientifiques fins	Réf. # 11255-20
Forceps, Dumont n° 55	Outils scientifiques fins	Réf. # 11252-20
Bloc chauffant	Labtech International	Chat # Bloc Dri Digi2
Microscope à fluorescence inversée	Zeiss	Cat# Axiovert 200
source lumineuse	Olympe	Cat# Highlight 3100
Régulateur de pression manuel	McMaster Carr	Cat# 0-60 PSI 41795K3
Astuces pour les microchargeurs	Eppendorf	N° de catalogue : 5242956.003
microcontrôleur	Arduino	Cat# Arduino Due
Caméra microscope Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3
Platine XY motorisée pour microscope
Pipettes Pasteur en plastique
Boîte de Pétri, 60 x 15 mm	Greiner	Cat# 628102
Boîte de Pétri, 35 x 10 mm	Nunc	Cat# 153066
Boîte de Pétri, 34 x 14 mm, avec verre de couverture Microwell n° 1,5	MatTek	Cat# P35G-1.5-14-C
Porte-pipette	Warner Instruments	Cat# 64-2354 MP-s12u
Pipette et pointes
Filament d’extraction, filament carré de 3,0 mm	Instrument Sutter	N° de catalogue : FB330B
Boîte d’incubation de culture en tranches	MPI-CBG	Cat# sur mesure
électrovanne	Cat# LHDA053321H-A
Centrifugeuse de table	Hérée	Cat# 5431622
thermomètre
Manipulateur à trois axes	Sensapex Inc	Cat# arbre-axe uMP
Vibratome	Leica	Cat# VT1000s
Incubateur de système de culture d’embryons entiers	Société Ikemoto	Cat# RKI-10-0310
Bain d’eau
Logiciels et algorithmes
Arduino	Arduino
Fidji	Numéro de référence : SCR_002285
python	Fondation du logiciel Python	Python 2.7.12
zen		RRID : SCR_013672