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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Retirez les cellules de cumulus des œufs fécondés.
- Sous un stéréomicroscope, utilisez 2 seringues à insuline : la première pour maintenir l’oviducte et la seconde pour déchirer l’ampoule et disperser les œufs fécondés dans la solution de travail de l’hyaluronidase.
- Prenez la pipette en verre préparée pour la collecte des œufs et connectez-la au tube et à un filtre de 0,22 μm monté sur l’embout buccal pour aspirer tous les œufs. Récupérez tous les œufs et lavez-les par passage successif dans 6 gouttes différentes de 100 μL de milieu M2.
- Placez les œufs fécondés lavés dans un incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère de 5 % de CO2 dans un milieu M16.
2. Fabrication de pipettes d’injection
- Utilisez un tube capillaire en verre à paroi mince (10-15 cm de long) d’un diamètre extérieur de 1 mm et fixez ce capillaire dans un extracteur de micropipette horizontal.
note: Dans la plupart des extracteurs de pipettes horizontaux, 3 paramètres peuvent être réglés : la puissance thermique, la force de traction et le temps de temporisation entre le chauffage et le tirage. Ajustez ces paramètres pour obtenir des pipettes d’injection qui ressemblent à celles présentées sur la Figure 1A. Pour les utilisateurs qui effectuent régulièrement des micro-injections d’ADN, utilisez les paramètres standard et ajustez le délai entre le chauffage et le tirage pour modifier la forme globale de la pointe de la pipette.
3. Fabrication de pipettes de maintien
- Utilisez une pipette d’injection pour préparer la pipette de maintien.
- Fixez une pipette d’injection à une microforge. Couper la pipette à l’aide de la microforge pour obtenir une pointe symétrique pointue de 80 à 100 μm de diamètre. Polissez ensuite la pointe à la chaleur sur la microforge pour obtenir une forme ronde symétrique sans haies acérées.
4. Préparation d’une pipette d’injection contenant le vecteur lentiviral
- Centrifuger la suspension de vecteur lentiviral à 160 x g pendant 2 min pour récupérer les débris de pastilles souvent présents dans les stocks de lentiviraux congelés.
- Récupérer le surnageant et le transférer dans un nouveau tube de 0,5 mL dans une enceinte de sécurité de classe II.
- Transvaser 1 μL de surnageant dans une pipette d’injection préparée comme décrit à l’étape 5 à l’aide d’un microchargeur.
- Placez la pipette d’injection sur le porte-instrument du micromanipulateur droit. Connectez la pipette de maintien au micromanipulateur gauche.
note: Le titre de transduction du vecteur lentiviral sera directement corrélé à l’efficacité de la production fondatrice. Pour une efficacité élevée (>70 %), utilisez des vecteurs viraux avec un titre de l’ordre de 100 ng de protéine de capside p24/μL. Lorsque le titre est exprimé en unités de transduction (UT), il doit être supérieur à 109 UT/mL. Les stocks de vecteurs lentiviraux doivent être produits par transfection transitoire de cellules 293T avec le plasmide d’encapsidation p8.91, pHCMV-G, codant pour la glycoprotéine-G du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV), comme décrit dans les méthodes supplémentaires.
5. Micro-injection
- Distribuer 8 μL de milieu M2 au centre d’une lame de dépression et couvrir d’huile de paraffine légère (testée sur l’embryon) pour éviter l’évaporation.
- Placez 20 œufs dans la goutte le moins dispersé possible.
prudence: Ne faites pas de bulles lors du dépôt des embryons.
- Assurez-vous que l’extrémité de la pipette d’injection est ouverte. Si ce n’est pas le cas, tapotez la pipette d’injection avec la pipette de maintien.
- Réglez le micro-injecteur pour un temps d’injection de 20 s.
note: La viscosité de la suspension virale permet de visualiser clairement la dispersion du vecteur viral dans l’espace périvitellin. La pression d’injection doit être ajustée pour remplir tout l’espace dans les 20 s suivant l’injection, ce qui représente un volume de 10 à 100 pL. La pression d’injection ne doit pas dépasser 600 hPa.
- Aspirez un ovule fécondé contenant 2 pronoyaux et 2 globules polaires avec la pipette de maintien sous le stéréomicroscope.
- Injectez l’œuf avec le micro-injecteur dans l’espace périvitellin.
prudence: Ne touchez pas la membrane plasmique avec la pipette d’injection.
- Injectez tous les œufs fécondés disponibles par lots de 20 œufs et placez immédiatement les œufs injectés dans un milieu M16 préchauffé dans l’incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère de 5 % de CO2,
note: Incuber les ovules injectés pendant au moins 30 minutes après l’injection avant les transferts d’embryons.
