Chromatographie liquide à interaction hydrophile : une technique pour séparer les analytes polaires hydrophiles à l’aide de billes hydrophiles

Résumé

Source : Liu, D., et al. Analyse de l’immunoglobuline G N-Glycane par chromatographie liquide ultra-performante. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo démontre le principe de séparation des composés polaires hydrophiles à l’aide de la chromatographie liquide à interaction hydrophile. Cette technique aide à la purification de divers analytes polaires, y compris les N-glycanes.

Protocole

1. Chromatographie d’interaction hydrophile et analyse des glycanes

1. Conditionnement des instruments UPLC et préparation des phases mobiles
   1. Préparez les phases mobiles comprenant le solvant A : 100 mM de formiate d’ammonium (pH = 4,4), le solvant B : 100 % d’acétonitrile, le solvant C : 90 % d’eau ultra-pure (10 % de méthanol) et le solvant D : 50 % de méthanol (eau ultra-pure).
   2. Ouvrez le logiciel pour contrôler les phases mobiles.
   3. Laver les instruments UPLC à un débit de 0,2 mL/min (50 % de solvant B et 50 % de solvant C) en équilibrant pendant 30 min, puis à un débit de 0,2 mL/min (25 % de solvant A et 75 % de solvant B) en équilibrant pendant 20 min, puis un débit de 0,4 mL/min en équilibrant.
2. Dissoudre les N-glycanes prémarqués avec du 2-aminobenzamide (2-AB) dans 25 μL d’un mélange d’acétonitrile à 100 % et d’eau ultra-pure dans un rapport de 2:1 (v/v). Ensuite, centrifugez à 134 × g pendant 5 min (4 °C) et chargez 10 μL de N-glycanes marqués dans les instruments UPLC.
3. Séparez les N-glycanes marqués à un débit de 0,4 mL/min avec un gradient linéaire de 75 % à 62 % d’acétonitrile pendant 25 min. Ensuite, effectuez un cycle analytique par échelle d’étalonnage dextran/colonne glycopeptide sur un UPLC à 60 °C (ici, les échantillons ont été conservés à 4 °C avant l’injection).
4. Détecter la fluorescence de N-glycane à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 330 nm et 420 nm, respectivement.
5. Intégrez les glycanes en fonction de la position du pic et du temps de rétention.
6. Calculez la valeur relative de chaque pic de glycane (GP)/de tous les pics de glycanes (pourcentage, %) comme suit : GP1 : GP1/GPs*100, GP2 : GP2/GPs*100, GP3 : GP3/GPs*100, etc.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-aminobenzamide, 2-AB	Sigma, Chine
Acétonitrile	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chine
Ammonium formate	Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Échelle d’étalonnage de dextran/colonne de glycopeptide	Watts technology Co., Ltd, Chine
Empower 3.0	Waters technology Co., Ltd, Amérique
GlycoProfile 2-AB Labeling kit	Sigma, Chine
Méthanol	Huihai Keyi Technology Co.. , Ltd, Chine
Milli-Q eau pure meter	Millipore Co., Ltd, Amérique	202-2AB
Transfer	Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, Chine	Advantage A10
Réfrigérateur à très basse température	Thermo Co., Ltd, Amérique	PB-10
Chromatographie liquide ultra-performante	Watts technology Co., Ltd, Chine
Pompe à vide	Watts technology Co., Ltd, Chine	4672100, 0,5-10&mu ; l & 10 à 100 mu ; l & 20 à 200 mu ; l & 1000&mu ; l