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1. Dérivatisation par fluorescence des acides sialiques
- Préparez 10 ml de solution d’OPD, composée de 100 mg d’o-phénylènediamine et de 208 mg d’hydrogénésulfite de sodium dans 10 ml de H₂O distillé.
- Ajouter 20 μL de solution d’OPD aux échantillons d’acide sialique. Agiter vigoureusement pendant 30 s et incuber les échantillons pendant 4 h à 80 °C dans l’obscurité (c.-à-d. envelopper les microtubes dans du papier d’aluminium).
- Laissez refroidir les échantillons pendant 5 min, ajoutez 80 μL de H₂O distillé et centrifugez les tubes à 14 000 x g pendant 1 min.
- Transférez 80 μL du surnageant dans un flacon HPLC à haut niveau de récupération de 300 μL. Les échantillons d’acide sialique dérivé peuvent être conservés à une température de 4 à 6 °C pendant une semaine maximum.
2. Analyse HPLC des dérivés de l’acide sialique
- Analysez les échantillons à l’aide d’un système HPLC standard connecté à un détecteur de fluorescence en ligne.
- Utilisez une colonne C18 en phase inverse avec les dimensions standard de 250 mm de longueur et 4,6 mm de diamètre pour l’analyse.
- Préparer le solvant A en diluant 200 mL de solution mère avec 800 mL d’eau de qualité LCMS (LCMS - chromatographie en phase liquide par spectrométrie de masse). La solution mère elle-même peut être préparée comme suit :
- Ajouter 46 g d’acide formique à 800 ml de H₂O de qualité LCMS.
- Ajustez le pH à 4,5 en ajoutant goutte à goutte une solution d’hydroxyde d’ammonium (puriss. p.a.).
- Transférez le solvant dans un cylindre doseur et remplissez jusqu’à 1 000 ml de H₂O de qualité LCMS. Cette solution mère peut être conservée à une température de 4 à 6 °C jusqu’à 3 mois.
- Pour le solvant B, utilisez de l’acétonitrile de qualité LCMS.
- Séparer les dérivés des acides sialiques à un débit de 1 mL/min avec le gradient d’élution suivant :
- Commencez par ajouter 10 % de solvant B mélangé au solvant A.
- De 0 min à 15 min, augmentez progressivement la proportion de solvant B avec un gradient linéaire jusqu’à 60
%.
- De 15 min à 16 min, augmentez rapidement la proportion de solvant B avec un gradient linéaire de 60 % à 90 %. Cela déclenche le lavage de la colonne HPLC.
- Pour laver davantage la colonne HPLC, maintenez le niveau de solvant B à 90 % entre 16 min et 18 min avant de réduire progressivement le niveau de solvant B à 10 % entre 18 min et 19 min.
- Rééquilibrez la colonne HPLC aux conditions de départ de 10 % B entre 19 et 24 min.
- Injectez 50 μL d’échantillon dans le système HPLC.
- Surveiller les éluants à l’aide des longueurs d’onde d’excitation/émission du détecteur de fluorescence de 373/448 nm, et les acides sialiques dérivés peuvent être attendus aux temps de rétention approximatifs de 9 min (pour Neu5Gc-OPD) et de 10 min (pour Neu5Ac-OPD).
- Calculez la quantité relative de Neu5Gc (FNeu5Gc) à partir des zones de pics de fluorescence du Neu5Ac (ANeu5Ac) et du Neu5Gc (ANeu5Gc) comme suit :
FNeu5Gc [ %] = 100×ANeu5Gc/(ANeu5Ac+ANeu5Gc). Dans le cas du lait et du foie, les échantillons de souris knock-out homozygotes Cmah FNeu5Gc doivent être de 0 %, tandis que les valeurs de FNeu5Gc des souris hétérozygotes et de type sauvage peuvent varier considérablement en fonction de l’âge de la souris et du type de tissu (entre 2 % et >90 %), avec des marges d’erreur attendues de ±12 %.