Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Mesure du volume embryonnaire à l’aide du déplacement de l’eau
REMARQUE : Dans ce protocole, des embryons post-fécondation (hpf) de 24 h (Figure 1) sont utilisés. Les embryons utilisés dans les mesures de volume ne sont pas utilisés dans l’analyse de l’éthanol.
- Placez 10 embryons et du liquide extraembryonnaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL marqué à un volume de 250 μL (figure 2A). Ajouter de l’eau jusqu’à la ligne de remplissage de 250 μL (voir l’échantillon avec de l’eau colorée à la figure 2B).
- Répétez l’étape 1.1 pour installer les réceptacles pour les embryons dont le chorion a été enlevé.
- Pour retirer le chorion, placez les embryons dans leurs chorions dans une boîte de Pétri de 100 mm avec 2 mg/mL de cocktail de protéase dans un milieu embryonnaire à température ambiante (RT) pendant 10 min. Toutes les quelques minutes, faites tourner doucement les embryons pour briser le chorion.
- Une fois que tous les embryons sont libérés de leur chorion, retirez les embryons déchorionnés du cocktail de protéase/milieu embryonnaire et placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm avec un milieu embryonnaire frais pour laver les embryons. Répétez cette étape de lavage 1 fois de plus (pour un total de 2 lavages). Transférez les embryons dans une boîte de Pétri fraîche de 100 mm.
- À l’aide de la plus petite pointe possible et sans endommager les embryons, prélever soigneusement tout le liquide autour des embryons à l’aide d’une micropipette p200 (figure 2C) et peser l’eau à l’aide d’une balance avec une précision de <0,1 mg. Pour déterminer le volume de l’échantillon de 10 embryons, soustrayez le poids/volume de l’eau (1 mL d’eau = 1 g d’eau) retirée de 250 μL. Pour déterminer le volume d’un seul embryon, divisez la différence entre 250 μL et le poids de l’eau retirée par 10,
2. Traiter les embryons avec de l’éthanol
- Rassemblez les embryons des cuves d’accouplement et placez-les dans une boîte de Pétri standard de 100 mm. Ne comptez pas plus de 100 embryons par boîte de Pétri et incubez à 28,5 °C
note: Si le chorion doit être retiré (étape 1.2), il doit être retiré avant d’ajouter de l’éthanol.
- À 6 hpf, ajoutez jusqu’à 100 embryons dans une nouvelle boîte de Pétri standard de 100 mm, soit avec un milieu embryonnaire, soit avec un milieu embryonnaire + 1 % d’éthanol (v/v). Couvrez mais ne fermez PAS la boîte de Pétri. Placez les embryons dans un incubateur à basse température réglé à 28,5 °C pendant 18 h, ou jusqu’à ce que les embryons atteignent le point de développement de 24 hpf.
3. Préparation du flux de travail avant le traitement des embryons pour la chromatographie en phase gazeuse dans l’espace de tête
- Préparez une solution de 5 M de NaCl dans l’eau (450 μL seront nécessaires par tube d’échantillon) pour dénaturer toutes les protéines et empêcher le métabolisme de l’éthanol. Préparez le cocktail de protéase à une concentration de 2 mg/mL dans un milieu embryonnaire.
- Étiqueter un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et un flacon de chromatographe en phase gazeuse de 2 mL pour chaque échantillon. Étiqueter les flacons de chromatographe en phase gazeuse de 2 mL supplémentaires pour les étalons d’éthanol décrits ci-dessous, ainsi que l’air, l’eau et les ébauches de cocktail de NaCl/protéase de 5 M.
- Installez trois micropipettes p200, deux à 50 μL et la troisième à 200 μL ; une micropipette p1000 à 450 μL et une micropipette p2 à 2 μL. Pour les pipettes en verre utilisées pour transférer les embryons des boîtes de Pétri vers les tubes de microcentrifugation de 1,5 ml, passez rapidement la pointe de la pipette à travers une flamme pour lisser les bords afin de ne pas endommager les embryons lors de leur introduction dans la pipette.
4. Traitement des embryons pour la chromatographie en phase gazeuse dans l’espace de tête
REMARQUE : Les embryons dans leurs chorions et ceux précédemment retirés de leurs chorions sont traités de la même manière pour des raisons de cohérence dans le calcul des facteurs de dilution.
- À l’aide des deux micropipettes p200 réglées à 50 μL, aspirez 50 μL de la solution cocktail de protéase dans l’une et aspirez 50 μL d’eau dans la seconde.
- À l’aide de la pipette en verre et du micropipeteur, placez rapidement 10 embryons (de l’étape 2.2) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et fermez le capuchon (comme décrit à la figure 2A). Répétez l’opération pour tous les échantillons à analyser, les témoins et les embryons traités à l’éthanol.
- À l’aide de la micropipette p200 réglée à 200 μL, ouvrez rapidement le capuchon et retirez tous les milieux embryonnaires résiduels (comme décrit à la figure 2C). Placez rapidement la pipette contenant 50 μL d’eau dans le tube et ajoutez rapidement mais doucement (pour ne pas endommager les embryons) puis retirez l’eau. Ajoutez rapidement 50 μL de la solution cocktail de protéase de la pipette en attente et fermez le capuchon du tube (Figure 2D).
note: Effectuez ce processus un échantillon à la fois.
- Laissez l’échantillon reposer à RT pendant 10 minutes pour permettre au cocktail de protéase de dégrader le chorion. Ajoutez ensuite rapidement 450 μL de NaCl 5 M et fermez le capuchon du tube (Figure 2E). Vortex les échantillons pendant 10 min. Pour accélérer le processus, configurez le mélangeur pour vortex plusieurs échantillons en même temps.
REMARQUE : Ajouter une petite quantité (~100 μL) d’un mélange de billes de silice (2 tailles, billes de 0,5 mm et 1 mm) à tout tube contenant des embryons de plus de 24 hpf. Chez les embryons plus âgés, la notocorde restera intacte, quelle que soit la durée de leur homogénéisation.
- Après l’homogénéisation pendant 10 min, prélever rapidement 2 μL de surnageant embryonnaire homogénéisé et l’ajouter à un flacon de chromatographe en phase gazeuse. Scellez rapidement le flacon avec le bouchon en polytétrafluoroéthylène.
5. Préparation des supports et des étalons pour l’éthanol
- Pour préparer les étalons de milieu, diluez le milieu d’un facteur 10 avec une solution cocktail NaCl/protéase 5 M. Ajouter 2 μL de chaque échantillon dans un flacon de chromatographe en phase gazeuse et sceller avec un bouchon en polytétrafluoroéthylène.
- Pour préparer les étalons d’éthanol, il faut procéder à une dilution en série de 100 % d’éthanol dans une solution cocktail de NaCl/protéase 5 M aux concentrations suivantes : 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 et 40 mM. Ajouter 2 μL de chaque étalon dans un flacon de chromatographe en phase gazeuse et sceller avec un bouchon en polytétrafluoroéthylène.
6. Préparation de la chromatographie en phase gazeuse dans l’espace de tête
REMARQUE : La chromatographie en phase gazeuse dans l’espace de tête est utilisée pour quantifier les niveaux d’éthanol, et non pour la séparation.
- Réglez le chauffage de l’échantillonneur automatique à 58 °C et allumez-le. Laissez l’appareil de chauffage atteindre 58 °C et allumez les conduites d’air et d’hydrogène gazeux alimentant le chromatographe en phase gazeuse (pour l’ionisation de la flamme utilisée pour quantifier l’éthanol).
REMARQUE : Le psi doit être réglé pour faire fonctionner correctement le chromatographe conformément aux spécifications du fabricant. Assurez-vous que la ligne d’hélium est activée et réglée au bon psi.
- Pour le septum, assurez-vous que le nombre d’échantillons injectés n’est pas >100. Pour la fibre d’injection, assurez-vous que le nombre d’échantillons injectés n’est pas >500.
REMARQUE : Si l’un ou l’autre dépasse le nombre d’injections, ils devront être changés avant d’analyser les échantillons de test.
- Allumez le logiciel d’analyse et assurez-vous que le poste de travail est correctement configuré. Stockez toutes les données conformément aux normes du laboratoire/département. Créez une liste d’exemples pour les exemples à exécuter.
- Lancez la méthode de démarrage et attendez que le détecteur à ionisation de flamme se stabilise avant d’analyser les échantillons. Une fois stable, exécutez la méthode de démarrage du logiciel pour nettoyer la fibre.
7. Mesures d’échantillons par chromatographie en phase gazeuse dans l’espace de tête
- Une fois la méthode de démarrage terminée, créez 1 nouvelle ligne par échantillon dans la liste d’échantillons. Depuis le menu des méthodes du logiciel d’analyse, chargez 436 Current spme ethanol 2013 3min absorber 2_5min rg run. METH pour chaque échantillon de la liste d’échantillons.
- Remplissez la liste d’échantillons, en commençant par les ébauches de cocktail d’air, d’eau et de 5 M de NaCl/protéase. Entrez ensuite dans les normes dans l’ordre, de 0,3125 à 40 mM. Suivez les normes avec un deuxième tour d’air, d’eau et de 5 M de NaCl/protéase à cocktail blanc.
- Inscrivez tous les échantillons de surnageant embryonnaire homogénéisé à analyser, de la concentration d’éthanol la plus basse à la concentration maximale prévue. Terminez en entrant dans un troisième et dernier tour de l’air, de l’eau et 5 M de cocktails NaCl/protéase.
- Ajouter les flacons de chromatographe en phase gazeuse dans l’échantillonneur automatique dans l’ordre dans lequel les échantillons ont été saisis. Laisser les échantillons se réchauffer pendant 10 à 15 min. Démarrez les exécutions d’échantillons dans le logiciel.
- Une fois que tous les échantillons et les derniers blancs ont été exécutés, activez la méthode d’arrêt dans le logiciel en ajoutant un dernier échantillon dans la liste d’échantillons et en l’exécutant en veille. MÉTHAMPHÉTAMINE. Sauvegardez toutes les données acquises au cours des exécutions d’échantillons. Éteignez l’équipement dans l’ordre suivant : le chauffage de l’échantillonneur automatique, le réservoir d’hydrogène et, seulement après que la température du chromatographe atteint 30 °C, le réservoir d’air. Laissez le réservoir d’hélium allumé pour préserver la colonne de cire.
8. Intégration du pic d’éthanol de l’échantillon et analyse de la concentration de l’échantillon
REMARQUE : Toutes les valeurs à partir de 8.3 ont été calculées dans un fichier excel que toutes les équations ont prérempli.
- Une fois la méthode d’arrêt terminée, cliquez sur Ouvrir le chromatogramme. Ouvrez le dossier contenant les résultats. Les échantillons sont automatiquement intégrés dans ce programme.
- Dans les résultats, assurez-vous que les bons pics ont été intégrés (pics d’éthanol entre 2 et 2,5). Une fois que tous les échantillons ont été confirmés, imprimez ou exportez les résultats.
- Tracez la hauteur maximale des étalons d’éthanol sur un graphique. Calculez la pente, l’ordonnée à l’origine Y et les valeurs R2 pour les étalons d’éthanol (R2 doit être >0,99).
note: Ces valeurs seront utilisées pour déterminer la concentration d’éthanol à partir de la hauteur du pic de l’échantillon.
- Pour chaque échantillon, soustrayez la hauteur du pic de l’échantillon de l’ordonnée à l’origine Y des étalons d’éthanol. Divisez cette valeur par la pente des étalons d’éthanol pour obtenir la valeur d’éthanol pour chaque échantillon dans les flacons GC.
