Électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif bleu : une technique de séparation non dénaturante pour l’analyse de complexes de chaînes respiratoires mitochondriales intactes

Résumé

Source : Konovalova, S. Analyse des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale dans des cellules humaines en culture à l’aide de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif bleu et de l’immunobuvardage. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous démontrons une technique électrophorétique, appelée PAGE native bleue, pour l’analyse des complexes protéiques respiratoires mitochondriaux dans leur état nativement replié et fonctionnellement actif. Le colorant anionique bleu de Coomassie provoque la charge négative des complexes protéiques, ce qui permet une séparation en fonction de la taille et de la structure.

Protocole

1. Préparation des tampons et des solutions

REMARQUE : Tous les tampons et solutions utilisés dans le protocole sont résumés dans le Tableau 1. Les volumes donnés des tampons sont suffisants pour préparer et analyser 10 échantillons. Tous les tampons peuvent être stockés à +4 °C pendant un an maximum.

1. Préparez 20 mL de 3 tampons de gel contenant 1,5 M d’acide aminocaproïque, 150 mM de Bis-tris dans de l’eau distillée (dH₂O). Ajustez le pH à 7,0.
2. Préparez 10 mL d’acide aminocaproïque 2 M dans dH₂O.
3. Préparez 1 mL de tampon mitochondrial en....

Résultats

Tableau 1 : Tampons et solutions utilisés pour BN-PAGE

Tampon ou solution	composition	recette
3 x tampon de gel	1,5 M d’acide aminocaproïque	3,94 g d’acide aminocaproïque
	150 mM Bis-tris	0,63 g de Bis-tris

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques de cellules de 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182
40 % Acrylamide/Bis 37,5:1	Bio-Rad	Référence 161-0148
Acide aminocaproïque	sigma	A2504
Persulfate d’ammonium	sigma	A3678
Bis-tris	sigma	Réf. B7535
Kit de dosage des protéines Bradford	BioRad	5000006
Racleurs de cellules	pêcheur	11597692
Bleu Coomassie G250 (Serva Blue G)	Serva	Référence 35050
Digitonine	sigma	D141
DMEM	Lonza	12-614F/12
Edta	Technologies de la vie	Référence 15575-038
FBS	Technologies de la vie	10270106
Sérum fœtal bovin	Technologies de la vie	10270106
glycérol	sigma	Référence G5516
Créateur de dégradés	Bio-Rad	1654120
Lauryl maltoside (n-Dodécyl β-D-maltoside)	sigma	D4641
L-glutamine	Technologies de la vie	25030024
L-glutamine	Gibco	Référence 25030
N,N,N′,N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)	sigma	Réf. T9281
Pbs	Technologies de la vie	BE17-516F
Pénicilline/streptomycine	Lonza	17-602E
Pénicilline/streptomycine	Gibco	Référence 15140
alimentation	GE Soins de santé	SPE 301
Inhibiteurs de la protéase	Thermo Scientific	10137963
Trans-blot turbo mini PVDF	BioRad	1704156
Tricine	sigma	Réf. T9784
Trypsine-EDTA	Gibco	15400054
Appareil d’électrophorèse verticale	BioRad	1658004