1. Préparation des tampons et des solutions
REMARQUE : Tous les tampons et solutions utilisés dans le protocole sont résumés dans le Tableau 1. Les volumes donnés des tampons sont suffisants pour préparer et analyser 10 échantillons. Tous les tampons peuvent être stockés à +4 °C pendant un an maximum.
- Préparez 20 mL de 3 tampons de gel contenant 1,5 M d’acide aminocaproïque, 150 mM de Bis-tris dans de l’eau distillée (dH2O). Ajustez le pH à 7,0.
- Préparez 10 mL d’acide aminocaproïque 2 M dans dH2O.
- Préparez 1 mL de tampon mitochondrial en combinant ce qui suit : 0,5 mL de 3x tampon de gel, 0,5 mL d’acide aminocaproïque 2 M et 4 μL de 500 mM d’EDTA.
- Préparez 1 000 mL de tampon cathodique contenant 15 mM de Bis-tris et 50 mM de tricine dans dH2O. Ajustez le pH à 7,0.
- Préparez 200 mL de tampon cathodique bleu en ajoutant 0,04 g de Coomassie blue G-250 à 200 mL de tampon cathodique.
- Préparez 1 000 mL de tampon d’anode contenant 50 mM de Bis-tris dans dH2O. Ajustez le pH à 7,0.
- Préparez 2,5 mL de tampon d’échantillon contenant 750 mM d’acide aminocaproïque et 5 % de bleu de Coomassie G-250 en dH2O.
2. Préparation des lysats mitochondriaux
- Plaquez les cellules la veille du prélèvement. Pour les cellules HEK293 ou 143B, utilisez le milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de L-glutamine, 100 mg/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine. Cultivez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à +37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. Assurez-vous qu’il y a au moins 500 000 cellules pour chaque échantillon le jour du prélèvement.
- Lavez doucement les cellules une fois avec du PBS glacé. Évitez de détacher les cellules de la plaque. Grattez les cellules et granulez-les à 800 x g pendant 10 min à +4 °C.
- Lavez la pastille cellulaire deux fois avec du PBS glacé et centrifugez-la comme à l’étape 2.2. Mesurez la concentration en protéines avec la méthode Bradford à l’aide d’un kit commercial. Granulez les cellules à 800 x g pendant 10 min à +4 °C.
note: Après le prélèvement des cellules, effectuez toutes les étapes à +4 °C et ne faites pas de vortex.
- Préparez 20 ml de PBS avec un inhibiteur de protéase en ajoutant 200 μL d’inhibiteur de protéase 100x à 20 ml de PBS. Restez sur la glace. Remettre en suspension les cellules dans le PBS avec un inhibiteur de protéase jusqu’à une concentration finale de protéines de 5 mg/mL.
- Pour calculer le volume de PBS avec inhibiteur de protéase nécessaire pour remettre les cellules en suspension à 5 mg/mL, calculez la quantité de protéines dans chaque échantillon. Pour ce calcul, utilisez la concentration en protéines mesurée à l’étape 2.3 et le volume de PBS utilisé pour remettre les cellules en suspension après le lavage à l’étape 2.3.
- Préparez 1 mL de 3,3 mM de digitonine dans du PBS avec un inhibiteur de protéase. Ajouter 3,3 mM de digitonine à une concentration finale de 1,65 mM. Bien mélanger et incuber sur glace pendant 5 min.
- Pour préparer 1 mL de 3,3 mM de digitonine dans du PBS avec inhibiteur de protéase, dissoudre 4 mg de digitonine dans 1 mL de PBS à 100 °C jusqu’à ce qu’aucun précipité ne soit visible et refroidir immédiatement sur de la glace. Ajouter 10 μL d’inhibiteur de protéase 100x à 1 mL de solution de digitonine.
note: N’utilisez qu’une solution fraîche de digitonin.
prudence: La digoninine est toxique ! Utilisez un masque facial, des gants et une blouse de laboratoire.
- Ajouter le PBS avec inhibiteur de protéinase (préparé à l’étape 2.4) au volume final de 1,5 mL. Centrifuger à 10 000 x g pendant 10 min à +4 °C. Retirer le surnageant. Dans cette étape, les mitochondries sont granulées.
- Remettez en suspension la cule mitochondriale dans le tampon mitochondrial. Le volume du tampon mitochondrial est la moitié du volume de PBS à l’étape 2.4.
- Préparez du laurylmaltoside frais à 10 % dans du PBS contenant un inhibiteur de protéase (préparé à l’étape 2.4). 1 mL suffit pour 10 échantillons. Ajouter 10 % de lauryl maltoside à la concentration finale de 1 %. Incuber sur glace pendant 15 minutes (cette étape peut être plus longue jusqu’à quelques heures).
- Centrifuger à 20 000 x g pendant 20 min à +4 °C. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube. Mesurez la concentration en protéines par la méthode Bradford à l’aide d’un kit. Ajoutez un tampon d’échantillon, un volume qui correspond à la moitié du volume de lauryl maltoside utilisé à l’étape 2.8. Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à 6 mois.
3. Préparation du gel de gradient pour BN-PAGE
- Versez le gel dégradé pour BN-PAGE à température ambiante. Placez l’appareil à gradient sur une plaque d’agitation et connectez-le à la pompe péristaltique à l’aide d’un tube flexible. Fixez un set de perfusion avec l’aiguille à la tubulure. Placez un agitateur magnétique dans la chambre proximale du générateur de gradient. Lavez la tubulure avec du dH2O à la vitesse maximale de la pompe pendant 10 min.
- Videz le tube et le fabricant de dégradé. À l’aide d’une pipette, il faut enlever les restes de dH2O dans le canal entre les chambres du fabricant de gradient. Fermez le canal et le tube avec la vanne.
- À l’aide d’un cadre moulé et de pinces, assemblez deux plaques de verre dans le support, qui a un trou sur le fond, et placez-le sur le support. Assurez-vous qu’il est plus ou moins sur une surface droite avec un équilibre hydrique. Placez l’aiguille reliée au tube entre les plaques de verre.
- Préparez des solutions de gel à 6 % et à 15 % (tableau 2). Restez sur la glace. Ajoutez le persulfate d’ammonium (APS) et la tétraméthylènediamine (TEMED) (ils commencent la polymérisation) en dernier. Mélangez doucement pour éviter de faire des bulles d’air.
- Chargez l’extrémité proximale de la chambre de tubulure du mélangeur de gel à gradient avec 6 % de gel et l’extrémité distale avec 15 % de gel. Le volume total du gel doit être égal au volume du gel de séparation entre les plaques de verre. Ainsi, utilisez 2,6 ml de gel à 6 % et 2,1 ml de gel à 15 % dans le mélangeur de gel à gradient pour un gel de 8,3 cm x 7,3 cm.
- Allumez l’agitateur magnétique et ouvrez le tube et le canal entre les chambres du fabricant de gradient. Allumez immédiatement la pompe péristaltique à 5 mL/min. Remplissez les plaques de verre et ne laissez pas de bulles pénétrer dans le gel. Retirez l’aiguille lorsqu’il n’y a pas de gel dans le tube.
- Recouvrir délicatement le gel de dH2O. Conserver le gel à température ambiante pendant au moins 1 h pour la polymérisation.
- Immédiatement après avoir versé le gel, laver la tubulure en remplissant les chambres de gradient avec du dH2O et en utilisant la pompe péristaltique à vitesse maximale. Lorsque vous préparez deux gels ou plus, nettoyez toujours le système entre les deux.
- Préparez 1 tampon de gel en mélangeant 3 ml de tampon de gel 3 et ajoutez 6 ml de dH2O. Retirez doucement le dH2O de la surface du gel avec du papier filtre. Lavez la surface du gel avec 1x tampon de gel. Retirez doucement 1x tampon de gel avec du papier filtre.
- Évitez les fibres du papier filtre sur le gel. Pour vous en assurer, coupez le papier en petits morceaux avec des ciseaux, mais ne déchirez pas le papier.
- Placez le peigne entre les plaques de verre, mais ne l’immergez pas complètement pour pouvoir verser le gel d’empilage sous le peigne. Préparez le gel d’empilage à 4 % (tableau 2). Ajoutez APS et TEMED en dernier car ils commencent facilement la polymérisation. Mélangez doucement en évitant les bulles d’air.
- Superposez le gel d’empilage, en évitant les bulles sous le peigne, et immergez complètement le peigne. Laissez le gel d’empilage polymériser pendant au moins 30 min. Retirez le peigne et lavez les puits avec 1x tampon de gel à l’aide d’une pipette.
- Après polymérisation, le gel peut être stocké à +4 °C pendant quelques jours. Pour conserver le gel, enveloppez-le dans du papier imbibé de dH2O et d’un film plastique pour éviter le dessèchement du gel.
4. Électrophorèse sur gel natif bleu
REMARQUE : Pour éviter la dégradation des complexes OXPHOS, exécutez l’électrophorèse à +4 °C. Utilisez des tampons pré-refroidis.
- Chargez la cassette de gel avec le tampon cathodique bleu jusqu’au fond des puits. Le chargement des échantillons est plus facile lorsque la cassette n’est pas remplie jusqu’en haut. Lavez les puits avec le tampon à cathode bleue, puis remplissez les puits avec le tampon à cathode bleue à l’aide d’une pipette.
- Chargez les échantillons (5 à 30 μg de protéines) dans des puits. Remplissez doucement la cassette de gel jusqu’en haut avec le tampon cathodique bleu et le réservoir avec le tampon d’anode.
- Faites fonctionner le gel pendant 15 min à une tension constante de 40 V. Augmentez ensuite la tension à 80 V (ou utilisez un courant constant de 6 mA), ne dépassez pas 10 mA. Passez le gel jusqu’à ce que le colorant atteigne les 2/3 de la longueur du gel.
- Remplacez le tampon cathodique bleu par un tampon cathodique et continuez l’électrophorèse jusqu’à ce que le front de colorant soit épuisé. Au total, l’électrophorèse dure environ 3 heures.
- Récupérez les plaques de verre et transférez les protéines dans la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) par transfert semi-sec.