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1. Fonctionnalisation de la puce avec l’anticorps biotinylé
- Préparez les solutions suivantes.
- Tampon T50, une solution de 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) et de 50 mM de NaCl. La solution est stable depuis 1 mois chez RT.
- T50-BSA en complétant le tampon T50 avec 0,1 mg/mL de BSA. Conservez la solution préparée sur de la glace.
- 10 mg/mL de borohydrure de sodium (NaBH4) dans 1x PBS. Préparez-le immédiatement avant utilisation.
- 0,2 mg/mL de NeutrAvidin (voir le tableau des matières) dans le tampon T50.
prudence: Le NaBH4 est un agent réducteur et est inflammable. Purgez toujours le récipient avec de l’azote gazeux après utilisation et rangez-le dans un dessiccateur.
- Fonctionnaliser la puce avec l’anticorps biotinylé.
- Retirez les matrices fonctionnalisées PEG-biotine du congélateur et équilibrez le tube conique sur RT avant de l’ouvrir. Placez la lamelle avec le réseau orienté vers le haut sur une boîte de culture tissulaire de 100 mm tapissée d’un film d’étanchéité.
note: Minimisez l’éclairage zénithal. Toutes les solutions doivent « perler » sur les carrés définis par le réseau hydrophobe. Ajoutez un volume approprié de solution pour couvrir complètement chaque carré (généralement 10 à 15 μL) et ne laissez pas le liquide déborder de l’espace défini. Pour évacuer rapidement les liquides, utilisez une conduite d’aspiration interne attachée à une bouteille à vide pour capturer les déchets. Laissez le NaBH4 dégazer pendant 1 h avant de l’éliminer en laissant le tube ouvert dans la hotte chimique. Le traitement NaBH4 est nécessaire pour réduire l’autofluorescence de fond, réduisant ainsi les détections de molécules uniques faussement positives.
- Traitez chaque carré de la matrice avec 10 mg/mL de NaBH4 dans 1x PBS pendant 4 min à RT. Laver trois fois avec du PBS.
- Incuber chaque carré pendant 5 minutes avec 0,2 mg/mL de NeutrAvidin dans T50. Laver trois fois avec T50-BSA.
note: NeutrAvidin se lie à la PEG-biotine et fournit un site de liaison pour les anticorps biotinylés.
- Incuber chaque carré pendant 10 minutes avec 2 μg/mL d’anticorps biotinylés spécifiques du POI dans le T50-BSA ; laver trois fois avec T50-BSA.
note: Le protocole actuel utilise des IgG anti-EGFR biotinylées (voir le tableau des matériaux) pour capturer l’EGFR-GFP.
2. SiMPull de POI à partir de lysats de cellules entières
REMARQUE : Placez la parabole TC100 de réseaux SiMPull fonctionnalisés sur de la glace pour le reste de la préparation SiMPull. Cette étape est le tirage d’un POI à partir du lysat de protéines totales. Le lysat ne doit pas être réutilisé après décongélation.
- Préparez les solutions suivantes.
- Préparez 4 % de paraformaldéhyde (PFA)/0,1 % de glutaraldéhyde (GA) dans 1x PBS.
prudence: Les PFA et GA sont des fixateurs chimiques toxiques et des cancérogènes potentiels. Portez un EPI. Éliminez les produits chimiques en tant que déchets dangereux conformément aux réglementations et directives locales.
- Préparez 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4.
- Décongelez et mélangez le lysat en le pipetant doucement de haut en bas. Restez sur la glace.
- Diluer 1 μL de lysat dans 100 μL de T50-BSA/PPI.
note: Si nécessaire, déterminez le facteur de dilution approprié du lysat de protéines totales en appliquant une gamme de dilutions à la puce. La densité optimale de récepteurs SiMPull par zone de réseau est de 0,04-0,08/μm2.
- Incuber le lysat sur le réseau pendant 10 min, puis laver quatre fois avec du T50-BSA/PPI glacé.
- Diluez l’anticorps anti-phosphotyrosine conjugué à l’AF647 (voir le tableau des matériaux) dans du T50-BSA/PPI glacé et incubez sur la matrice pendant 1 h.
note: Dans le protocole actuel, une IgG pan anti-pTyr (PY99)-AF647 est utilisée pour identifier la population phosphorylée de EGFR-GFP. L’utilisation d’anticorps marqués directement élimine le besoin d’anticorps secondaires, ce qui augmente les options de marquage et améliore la cohérence des résultats. Les anticorps marqués par fluorescence peuvent être obtenus à partir de sources commerciales. S’ils ne sont pas disponibles dans le commerce, les anticorps peuvent être étiquetés sur mesure à l’aide de techniques de bioconjugaison standard, et des kits de bioconjugaison commerciaux sont disponibles. Chaque lot d’anticorps marqués par fluorescence doit être testé pour des conditions de marquage optimales en effectuant SiMPull pour mesurer une courbe de dose et trouver le point de saturation.
- Laver six fois avec du T50-BSA glacé pour un total de 6 à 8 min.
- Laver deux fois avec de la glace 1x PBS.
- Incuber le réseau avec une solution de PFA à 4 % / 0,1 % de GA pendant 10 min pour prévenir la dissociation des anticorps.
- Laver deux fois pendant 5 min chacun avec 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4/PBS pour inactiver les fixateurs.
note: Pour les expériences utilisant plus d’un anticorps (p. ex., détection de plusieurs sites de phosphotyrosine), répétez les étapes 2.5 à 2.9.
3. Acquisition d’images
REMARQUE : L’acquisition d’images monomoléculaires est effectuée à l’aide d’un objectif TIRF 150x et d’un séparateur d’images qui capture chaque canal spectral dans un quadrant spécifique de la caméra emCCD (voir Tableau des matériaux). Les images d’étalonnage sont d’abord acquises pour permettre le recalage des canaux et l’étalonnage du gain de la caméra avec une grille d’alignement de canaux nanostructurée (nanogrille) qui contient 20 x 20 réseaux de trous de 200 ± 50 nm à une distance intra-trou de 3 ± 1 μm (taille totale ~60 μm × 60 μm).
- Effectuez l’enregistrement de la chaîne en suivant les étapes ci-dessous.
note: Un recalage précis des canaux est nécessaire pour calculer correctement la colocalisation des émetteurs. Cette étape est cruciale.
- Nettoyez l’objectif à huile et déposez une goutte d’huile sur l’objectif. Placez la nanogrille sur la scène pour l’imagerie. À l’aide de la lumière blanche transmise, concentrez-vous sur le motif de la grille.
note: Les images avec la nanogrille sont acquises à l’aide de la lumière transmise, qui traverse la nanogrille et est détectée dans tous les canaux spectraux. Alternativement, on peut utiliser des billes multifluorescentes qui émettent une fluorescence détectée dans chaque canal. L’acquisition d’images devra être optimisée en fonction de la configuration de chaque microscope.
- Acquérez une série de 20 images de la grille. Assurez-vous que les pixels ne sont pas saturés. Enregistrez la série d’images sous le nom « Fiducial ».
- Défocalisez la nanogrille pour créer un motif Ary. Acquérez une série de 20 images pour les étalonnages de gain. Enregistrez l’image sous le nom « Gain ».
- Acquérez une série de 20 images pour le décalage de la caméra en empêchant toute la lumière d’aller à la caméra. Enregistrez l’image en tant qu'"Arrière-plan ».
- Acquisition de SiMPull images.
note: Avant d’imager le réseau de lamelles, remplacez la solution Tris par du T50-BSA et équilibrez le réseau en fonction de RT.
- Nettoyez l’objectif à huile et déposez de l’huile supplémentaire sur l’objectif. Fixez le réseau de lamelles sur la platine du microscope.
- Optimisez la puissance d'excitation, l'angle TIRF et le temps d'intégration de la caméra de chaque fluorophore. L’objectif est d’obtenir le rapport signal/bruit le plus élevé tout en minimisant le photoblanchiment de l’échantillon. Enregistrez la puissance du laser pour assurer la cohérence dans les mesures futures.
note: La présente étude a utilisé un temps d’exposition de 300 ms pour le canal rouge lointain et de 1 s pour le canal vert. Le laser de 642 nm a été utilisé à une puissance laser d’environ 500 μW, tandis que le laser de 488 nm a été utilisé à 860 μW, mesuré avant la lentille du tube.
- Acquérez des images pour chaque échantillon. Imagez d’abord le canal rouge lointain, suivi de chaque fluorophore de longueur d’onde inférieure pour réduire le photoblanchiment. En raison du faible volume utilisé pour chaque échantillon, vérifiez le niveau de la mémoire tampon toutes les 30 à 45 minutes et remplissez-le au besoin.