Dosage planaire des lipides bicouches : une technique in vitro basée sur la microscopie pour étudier l’assemblage de la septine sur des mimiques de membranes biologiques

Résumé

Source : Curtis, B. N. et al. Reconstitution de l’assemblage de la septine au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques. J. Vis. Exp. (2022)

Dans cette vidéo, nous montrons une procédure permettant d’étudier l’organisation de la septine sur une bicouche lipidique supportée de verre in vitro à l’aide de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale.

Protocole

1. Bicouches lipidiques planes

1. Nettoyage plasma des lames
   note: Le nettoyage au plasma élimine les contaminants organiques et augmente l’hydrophilie du verre, assurant ainsi une adsorption efficace des lipides. Les étapes suivantes peuvent changer ou doivent être optimisées en fonction du nettoyant plasma et des lamelles en verre utilisés.
   1. Purgez le nettoyeur plasma pendant 5 minutes avec de l’oxygène pour éliminer l’air des conduites et de la chambre. Il s’agit de s’assurer que, lorsque le nettoyeur plasma est exécuté, il y a principalement de l’oxygène dans les conduites et la chambre, ce qui permet d’obtenir des préparations bicouches plus cohérentes.
   2. Pendant la purge, faites passer un gaz inerte, tel que N₂ ou Ar, sur les lames de verre de micro-protection pour éliminer la poussière et les particules.
      optionnel: Les lames de verre de couverture peuvent être lavées en vaporisant chaque côté avec de l’isopropanol à 100 % suivi d’eau. Répétez le lavage à l’eau isopropanol 3 fois, puis séchez avec un jet N₂.
   3. Disposez les lames de verre à couverture sèche dans un berceau en céramique. Placez le berceau à l’arrière de la chambre à plasma de manière à ce que les lamelles soient parallèles au bord long de la chambre (cela les maintient en place pendant le nettoyage au plasma). Faites fonctionner le nettoyeur plasma pendant 15 minutes avec de l’oxygène à puissance maximale.
2. Préparation de la chambre
   note: La méthode décrite ici utilise des chambres faites maison à partir de tubes PCR en plastique pour supporter les volumes de réaction, mais d’autres matériaux à faible adhérence, tels que les puits en silicone, peuvent également convenir.
   1. À l’aide d’une lame de rasoir ou de ciseaux, coupez le capuchon juste en dessous de la partie givrée d’un tube PCR de 0,2 mL (Figure 1).
   2. Peignez le bord du tube PCR avec un adhésif activé par les UV, en évitant l’intérieur du tube. Placez délicatement le tube PCR collé au centre d’une lamelle nettoyée au plasma.
      note: Pour éviter la colle à l’intérieur de la chambre, utilisez la quantité minimale de colle pour obtenir une étanchéité et traitez rapidement avec des UV sans heurter ni perturber la chambre.
   3. Placez la chambre sous une lumière UV de grande longueur d’onde pendant 5 à 7 minutes pour durcir l’adhésif.
3. Formation bicouche
   note: Des SUV monodispersés doivent être utilisés à cette étape pour une formation efficace des deux couches. Le tableau 1 fournit des recettes pour tous les tampons utilisés dans la formation des deux couches, y compris les concentrations de la matière première et de la zone tampon finale.
   1. Ajouter 40 μL de tampon bicouche lipidique pris en charge (SLBB : 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl₂ ; Tableau 1), 10 μL de VUS de 5 mM et 1 μL de CaCl₂ de 100 mM dans le puits. Agitez doucement les chambres d’un côté à l’autre pour perturber les SUV, puis incubez à 37 °C pendant 20 min
      note: Pour limiter l’évaporation, incubez dans une boîte de Pétri couverte avec une lingette humide.
4. Élimination de l’excès de lipides
   note: Cette étape supprime les SUV en excès et agit comme une étape d’échange de tampon. Il est très important de ne pas gratter la bicouche avec la pointe de la pipette pendant le lavage ; Si le verre est exposé, les septines et de nombreuses autres protéines se lient de manière irréversible, réduisant ainsi la concentration efficace en protéines.
   1. Après l’incubation, rincer la bicouche 6x avec 150 μL de SLBB, en pipetant de haut en bas pour mélanger à chaque fois tout en évitant les bulles.
      REMARQUE : Ajouter 150 μL directement aux 50 μL de tampon et aux SUV déjà présents pour un total de 200 μL dans le puits de réaction.
   2. Lorsque vous êtes prêt à commencer l’incubation avec les septines ou une autre protéine de votre choix, lavez la bicouche 6x avec 150 μL de tampon de réaction (RXN : 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg/mL BSA, 0,14 % de méthylcellulose, 1 mM BME).
      REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, faites en sorte que le tampon de réaction soit frais et soyez très prudent lorsque vous mélangez bien la réaction pour éviter les bulles.
   3. Lors de la dernière étape de lavage, retirez 125 μL de tampon de réaction, en laissant 75 μL dans le puits. Ajouter 25 μL de septines diluées dans un tampon de stockage de septines (BSR : 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) à la concentration souhaitée et obtenir l’image par microscopie TIRF.
      note: Lors de la mise en place de ce test pour la première fois ou de l’incorporation d’une nouvelle composition lipidique, il est recommandé de s’assurer que les lipides se diffusent librement sur la surface en utilisant la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Bien que le taux de récupération soit différent pour différentes compositions lipidiques et intrinsèquement inférieur à celui des systèmes autonomes, les lipides ne doivent pas être immobiles.

Tableau 1 : Composants tampons pour la préparation de la bicouche lipidique supportée et des réactions. Les volumes de solutions mères incorporées dans les zones tampons et les concentrations finales de chaque composant sont indiqués. Le SLB et le PRB peuvent être conservés à température ambiante et réutilisés entre les expériences. Le tampon de réaction et la BLU sont rafraîchis pour chaque expérience.

Tampon bicouche lipidique pris en charge (SLBB)
stock	volume	Concentration finale
2 M KCl	1,5 mL	300 millions de mètres
1 M HEPES	200 μL	20 millions d’euros
500 mM MgCl2	20 μL	1 million d’euros
Eau	8 ml
Tampon de pré-réaction (PRB)
stock	volume	Concentration finale
2 M KCl	166 μL	33,3 millions d’euros
1 M HEPES	500 μL	50 millions d’euros
Eau	9,33 ml
Tampon de réaction
stock	volume	Concentration finale
2 M KCl	166 μL	33,3 millions d’euros
1 M HEPES	300 μL	50 millions d’euros
10 mg/mL de BSA	1,39 mL	1,39 mg/mL
1 % de méthylcellulose	1,39 mL	0,0014
Eau	Jusqu’à 10 mL
Bme	0,7 μL	1 million d’euros
Tampon de stockage de septine (SSB)
stock	volume	Concentration finale
2 M KCl	1,5 mL	300 millions de mètres
1 M HEPES	500 μL	50 millions d’euros
Eau	Jusqu’à 10 mL
Bme	0,7 μL	1 million d’euros

Résultats

Figure 1 : Schéma de la mise en place de la chambre de réaction. Pour préparer les chambres personnalisées, un tube PCR de 0,2 mL est coupé à l’endroit où le tube commence à se rétrécir et au niveau du capuchon (lignes pointillées rouges). Le bord non coupé du tube coupé est ensuite recouvert d’une fine couche de colle activée par les UV (bleu) et placé sur une lamelle.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes PCR de 0,2 mL avec capuchon plat, naturel	Watson	137-211C(EX)
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
chlorure de magnésium	VWR	Référence 7791-18-6
Méthylcellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	Référence M052-100G
Lamelles en microverre pour bicouches planes	Matsunami	Abandonné	22x22
Adhésif optique	Norland Thorlabs	NOA 68	Adhésif flexible pour verre ou plastique
Nettoyeur plasma	Gravure au plasma	PE-25	Tension : 120V, 60Hz. Courant : 15 AMPÈRES
chlorure de potassium	VWR	0395-1kg
Lampe UV	Spectroline	ENF-260C	115 volts, 60 Hz, 0,20 ampères
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Bêta-mercaptoéthanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
DOPC	Lipides polaires Avanti	850375
Oeuf Liss Rhodamine PE	Lipides polaires Avanti	810146