Dosage de la bicouche lipidique à support sphérique : une technique pour observer l’assemblage de la septine sur des microsphères

Résumé

Source : Curtis, B. N. et al., Reconstitution de l’assemblage de la septine au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo décrit la technique d’étude de l’assemblage de la protéine septine sur des microsphères recouvertes de bicouches lipidiques. Cette technique aide à comprendre les assemblages de protéines dépendants de la courbure sur des surfaces courbes.

Protocole

1. Bicouches lipidiques à support sphérique

REMARQUE : Ce protocole utilise des microsphères de silice en suspension dans de l’eau ultrapure à une densité de 10 %. Pour tout travail sur les paramètres cinétiques de l’assemblage des protéines, il est important de contrôler strictement la surface totale de la membrane entre les expériences et les courbures. Le tableau 1 montre les volumes corrigés des billes et du tampon pour maintenir 5^mm2 de surface totale de la membrane.

1. Formation bicouche
   note: En ce qui concerne les bicouches planes, il est important d’avoir des SUV de haute qualité pour une formation de bicouches robustes. Le tableau 1 répertorie le volume des billes d’une solution de densité de 10 % et leurs volumes SLBB respectifs qui sont utilisés pour obtenir une surface finale de 5 mm² pour une gamme de diamètres de billes.
   1. Les microsphères de silice (également appelées billes) ont tendance à se déposer et à s’agglutiner ; pour mélanger les billes et briser les amas de billets, faites un vortex dans la bouteille pendant 15 s, puis dans un bain de sonicate pendant 1 min, et un autre vortex pendant 15 s.
   2. Mélanger le volume approprié de billes (tableau 1) avec le volume correspondant de SLBB et 10 μL de VUS de 5 mM dans un tube de microcentrifugation à faible adhérence de 0,5 mL.
   3. Secouez le mélange billes et lipides d’un bout à l’autre pendant 1 h à température ambiante. Veillez à ce que cette incubation se fasse sur un rotateur pour éviter la sédimentation.
2. Préparation des chambres sur lamelles PEGylées
   note: En ce qui concerne les bicouches planes, des chambres faites maison à partir de tubes PCR en plastique sont utilisées pour supporter les volumes de réaction, mais d’autres matériaux à faible adhérence, tels que les puits en silicone, peuvent fonctionner tout aussi bien.
   1. Pendant que les billes se balancent, décongelez une lamelle pégylée à température ambiante. Coupez un tube PCR de 0,2 mL et collez-le sur la lamelle comme décrit. Pour les glissières de 24 mm x 50 mm, il est possible de tenir jusqu’à 10 chambres sur une seule glissière.
      note: Ce protocole utilise des lamelles en verre PEGylé de 24 mm x 50 mm qui sont préparées à l’avance. Brièvement, les lamelles en verre sont soigneusement nettoyées par sonication dans de l’acétone, du méthanol et du KOH 3M. Les lamelles sont ensuite fonctionnalisées avec du n-2-aminoéthyl-3-aminopropyltriméthoxysilane et liées de manière covalente au valérate de succinimidyle mPEG. Les lamelles de recouvrement PEGylées finies sont stockées sous vide à −80 °C. Bien que les lamelles en verre pégylé soient suggérées ici, d’autres moyens de passivation, tels que les méthodes BSA ou poly-L-lysine, peuvent être efficaces.
3. Élimination de l’excès de lipides
   note: Cette étape permet d’éliminer les SUV en excès et d’effectuer un échange de tampon. Les billes sont lavées 4 fois au total avec un tampon de pré-réaction (PRB : 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). Le tableau 2 répertorie les vitesses d’essorage en RCF pour une gamme de diamètres de billes.
   1. Faites tourner les billes à la FCR désignée pendant 30 s (tableau 2). Si vous utilisez plusieurs tailles de perles, faites pivoter les perles jusqu’à ce qu’il soit temps de les laver.
      note: Il ne vaut pas la peine de sédimenter des billes plus grosses dans la même rotation que des billes plus petites avec une vitesse de sédimentation de bille plus petite pour gagner du temps. Cela peut faire en sorte que les billes se collent les unes aux autres et compromettre l’intégrité de la bicouche.
   2. Après le premier essorage, prélever 50 μL de surnageant et ajouter 200 μL de PRB. Après les deuxième et troisième tours, retirez 200 μL et ajoutez 200 μL de PRB. Après le quatrième essorage, retirez 200 μL et ajoutez 220 μL de PRB. Pipeter vigoureusement pour chaque lavage.
      note: Le volume final de remise en suspension est différent de celui des lavages. Ne faites pas vortex les billes après l’incubation avec les lipides car cela peut laisser des espaces dans les bicouches. Pour éviter la sédimentation lors du travail avec les autres tailles de billes ou de la mise en place d’autres parties du test, replacez les mélanges de billes sur le rotateur bout à bout.
4. Préparation de la réaction
   1. Si vous effectuez un test de compétition avec plusieurs tailles de billes, faites un mélange 1:1 en mélangeant des volumes égaux de chaque taille de perle. Ensuite, mélangez 29 μL du mélange de billes souhaité (ou d’une seule bille) avec 721 μL de tampon RXN.
      note: Il est important de bien mélanger les billes à chaque étape à l’aide d’une pipette pour éviter les amas denses de perles ; Cela se traduira par une distribution plus uniforme des billes et une surface totale précise.
   2. Mélanger 75 μL de billes diluées et 25 μL de protéines diluées dans la BSR dans les puits.
      note: Les auteurs imagent généralement les complexes de septine de levure à 1-50 nM.
   3. Si vous mesurez les septines à l’état d’équilibre, incubez à température ambiante pendant 1 h, puis imagez par microscopie proche de TIRF ou par microscopie confocale.
      note: Cette réaction est conçue pour préserver la surface totale de la membrane de la réaction à 5^mm2 et pour produire une condition de réaction finale de 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, 0,1 % de méthylcellulose et 1 mM BME.

Tableau 1 : Volumes normalisés de microsphères. Afin de maintenir une surface égale de chaque taille de bille et de maintenir la surface totale de la membrane cohérente entre les expériences, les volumes pour chaque taille de bille et tampon qui normalisent la surface totale ont été calculés.

Diamètre de la perle (μm)	Volume des billes bien mélangées (μL)	Volume de tampon SLB (μL)	Volume des SUV (μL)
6,46	8,94	61.1	10
5.06	7	63	10
3.17	4,39	65,6	10
0,96	1,33	68,7	10
0,54	0,75	69,3	10
0,31	0,43	69,6	10

Tableau 2 : Vitesses de sédimentation pour des microsphères de différents diamètres. Pour chaque diamètre de bille, les vitesses de sédimentation minimales indiquées ont été utilisées pour granuler les billes afin d’éliminer les liposomes non liés

Diamètre du cordon (μm)	Vitesse de sédimentation (FCR)
0,31	4.5
0,54	4.5
0,96	2.3
3.17	0,8
5.06	0,3

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes PCR de 0,2 mL avec capuchon plat, naturel	Watson	137-211C(EX)
Tubes à faible adhérence de 0,5 mL	Scientifique américain	1405-2600
Bêta-mercaptoéthanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Couvre-objet pour la fabrication de lamelles PEGylées	Thermo Scientific	Référence 152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Verre de protection 24x50 #1.5
DOPC	Lipides polaires Avanti	850375
Oeuf Liss Rhodamine PE	Lipides polaires Avanti	810146
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Méthylcellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	Référence M052-100G
Mini centrifugeuse
Microsphères de silice non fonctionnalisées	Laboratoires Bangs, Inc.	Dépend de la taille : SS0200 * -SS0500 *	Silice en suspension aqueuse
Adhésif optique	Norland Thorlabs	NOA 68	Adhésif flexible pour verre ou plastique
chlorure de potassium	VWR	0395-1kg
Bain sonicateur	Branson	1510R-MT	Nettoyeur à ultrasons Bransonic. 50-60 Hz. Puissance : 70W
Soja PI	Lipides polaires Avanti	840044
Centrifugeuse de table	Eppendorf	Référence 22331
Lampe UV	Spectroline	ENF-260C	115 volts, 60 Hz, 0,20 ampères