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1. Culture de cellules épithéliales cornéennes humaines
- Cultivez du HCEC immortalisé dans des flacons de 75 cm² enduits de collagène avec 20 ml de milieu et de nutriment modifiés Eagle de Dulbecco (DMEM/F12) contenant 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine à 37 °C avec 5 % de CO2,
REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de secouer.
- Changez de support tous les 2 à 3 jours.
2. Préparation des cellules pour les tests
- Une fois que les cellules sont presque confluentes, retirez le milieu de culture.
- Ajouter 4 à 6 mL de solution de dissociation cellulaire dans chaque fiole de 75 cm². Incuber les cellules à 37 °C jusqu’à ce qu’elles se détachent (environ 20 à 30 minutes), en vérifiant périodiquement au microscope.
- Ajouter 2 à 6 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS dans chaque fiole de 75 cm².
- Transvaser le contenu de la fiole dans un tube à centrifuger de 50 mL.
- Centrifugez les cellules à 450-500 x g pendant 5 min. Pipetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu préchauffé.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Calculez le volume de support contenant un total de 1 x 105 cellules.
- Ajoutez 1 x 105 cellules dans chaque puits d’une plaque de culture recouverte de collagène-1 à 48 puits. Ajouter suffisamment de milieu dans le puits pour que le volume final de milieu dans le puits soit de 0,5 mL de culture DMEM/F12 avec 10 % de FBS.
REMARQUE : Une formulation de larme artificielle peut provoquer une cytotoxicité qui peut être mesurée par une diminution de l’activité métabolique du HCEC. L’uniformité des données dépend de l’ajout du même nombre de HCEC à chaque puits lors de l’ensemencement. La concentration de culture recommandée pour les plaques à 48 puits est de 1 x 105. Étant donné que les cellules de mammifères peuvent se déposer dans le tube de centrifugation après avoir été remises en suspension, il est recommandé de remettre les cellules en suspension par agitation fréquente tout en ensemencant les plaques avec des cellules afin que la suspension cellulaire ait le HCEC uniformément réparti.
- Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
3. Pas de protocole de dessiccation
- Procédure de contrôle
- Après 24 h d’incubation, retirer le milieu de culture de la plaque.
- Traiter immédiatement avec 150 μL d’une formulation d’essai et d’une solution de contrôle du milieu.
- Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 min.
- Retirer les solutions d’essai des cellules.
- Ajouter 0,5 mL de solution de colorant métabolique à 10 % pour tester l’activité métabolique. Incuber les cellules pendant encore 4 h à 37 °C et 5 % de CO2.
- Après la période d’incubation de 4 h, retirer 100 μL de solution de colorant métabolique de chaque puits et placer chaque 100 μL dans un puits d’une plaque à 96 puits.
- Mesurez la fluorescence de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes (Table des matériaux). Réglez la longueur d’onde d’excitation à 540 nm et la longueur d’onde d’émission à 590 nm.
- Pas de protocole de dessiccation (procédure de récupération)
- Répétez les étapes 3.1.1 à 3.1.4.
- Ajouter 0,5 mL de milieu DMEM/F12 dans chaque puits.
- Incuber un ensemble de cultures pendant 18 h à 37 °C et 5 % de CO2.
- Retirer le support et ajouter 0,5 mL de solution de colorant métabolique à 10 %. Répétez les étapes 3.1.6 et 3.1.7.