Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Croissance et préparation des inocules bactériens
- Décongeler des stocks de glycérol d'Helicobacter pylori (H. pylori) ou de H. felis à partir de -80 °C et une sous-culture sur des plaques de gélose au sang de cheval (HBA) comprenant : une base de gélose au sang n° 2 (voir le tableau des matériaux) ; un « supplément sélectif d'antibiotiques de Skirrow » modifié (composé de vancomycine, 10 μg/mL ; de polymyxine B, 25 ng/mL ; triméthoprime, 5 μg/mL ; amphotéricine B, 2,5 μg/mL) ; et 5 à 10 % (v/v) de sang de cheval. Les bactéries se développent bien dans des conditions microaérobies dans des bocaux anaérobies de 2,5 ou 3,5 L contenant les packs de gaz appropriés (voir le tableau des matériaux), à 37 °C
REMARQUE : Les souches de H. pylori cultivées dans ces conditions doivent être sous-cultivées après 1 à 1,5 jour d’incubation, alors que pour H. felis, au moins 2 jours d’incubation sont généralement nécessaires. Les milieux de culture et de stockage appropriés ont été décrits en détail précédemment.
- Préparez des inoculums bactériens pour l’infection de souris à partir de cultures en phase logarithmique précoce à moyenne. Récoltez doucement les bactéries sur les plaques de gélose en inondant chaque plaque de 1 à 2 ml de bouillon d’infusion cerveau-cœur (BHI). Aspirer les suspensions à partir de plaques avec des pipettes Pasteur.
- Vous pouvez également préparer des inoculums à partir de bactéries Helicobacter qui ont été propagées dans un bouillon BHI pendant 16 à 18 heures. Dans ce cas, prélever les bactéries par centrifugation à basse vitesse à 2 200 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Évaluer la viabilité et la motilité des bactéries en examinant les préparations de montage humide sous microscopie à contraste de phase (objectif 100X). Préparez des montages humides en remettant en suspension une boucle de bactéries dans une gouttelette de 10 à 20 μL de bouillon BHI sur une lame de microscope en verre. Dans le cas de H. felis, qui est une bactérie beaucoup plus grande que H. pylori, utilisez un hémocytomètre pour compter avec précision le nombre de bactéries viables. Confirmez la pureté de la culture en effectuant une coloration de Gram.
note: N’utilisez l’inocula de H. pylori que si la majorité des bactéries ont une forme bacillaire ou spirale (la morphologie peut varier en fonction de la souche). L’inocula de H. felis doit contenir principalement des bactéries de forme hélicoïdale.N’utilisez pas d’inoculums si la plupart des bactéries ont une morphologie coccoïde, car ces formes ne sont pas viables et n’établiront pas d’infection chez la souris.
- Estimez le nombre de bactéries dans l’inoculum en comptant au microscope à contraste de phase le nombre approximatif de bactéries par champ (objectif 100X) et en utilisant le guide suivant : 1 bactérie par champ = environ 106 unités formant colonies (UFC) d’Helicobacter/mL ; 10 bactéries par champ = environ 107 UFC/mL ; 100 bactéries par champ = environ 108 UFC/mL, etc.
- Lorsque vous utilisez un hémocytomètre, calculez l’UFC/mL à l’aide de la formule suivante :
UFC/mL = (nombre moyen de bactéries dans un champ 4 x 4) x (facteur de dilution) x (104).
- Ajuster la densité cellulaire bactérienne de l’inoculum à environ 107 à 108 UFC/mL par dilution dans un bouillon BHI, si nécessaire.
- Pour assurer une viabilité bactérienne maximale, utilisez l’inoculum pour le gavage intragastrique dès que possible après la préparation.
- Confirmez toujours la densité et la viabilité des cellules de H. pylori en effectuant un comptage viable des inoculaires immédiatement après la procédure de gavage (voir ci-dessous). Ce n’est pas toujours possible pour H. felis, car il ne forme généralement pas de colonies isolées sur les milieux de culture. Le nombre d’Helicobacterviables dans les inoculums ne peut pas être déterminé par la seule mesure de la densité optique (A600), car cette méthode ne fait pas de distinction entre les bactéries viables (c.-à-d. bacillaires/spirales/hélicoïdes) et non viables (c.-à-d. coccoïdes).
- Utilisez les valeurs de densité optique comme moyen d’estimer le nombre de bactéries H. pylori viables dans les inocules, mais dans ce cas, il est d’abord nécessaire de générer une courbe de croissance. Pour cela, les valeurs A600 des cultures de H. pylori sont surveillées au fil du temps et corrélées directement avec les nombres de bactéries viables, déterminés par comptage sur plaque.
note: Une méthode pratique pour effectuer de telles déterminations de la courbe de croissance consiste à cultiver des bactéries dans un milieu liquide (section 1.2), à l’aide de flacons de culture tissulaire standard à fond plat placés dans un incubateur à 10 % de CO2. Les nombres d’UFC, déterminés à partir des aliquotes des cultures obtenues toutes les 4 à 6 h pendant 2 à 3 jours, sont ensuite comparés aux valeurs correspondantes de A600. Il est important de noter que des courbes de croissance doivent être générées pour chaque souche de H. pylori, car celles-ci peuvent croître à des rythmes différents et, de plus, toutes les souches ne poussent pas bien avec 10 % de CO2.
2. Gavage intragastrique de souris avec Helicobacter
REMARQUE : Cette méthode de gavage intragastrique peut être appliquée à d’autres espèces bactériennes qui colonisent l’intestin, par exemple S. Typhimurium, C. rodentium, Listeria monocytogenes.
- Utilisez des souris mâles ou femelles âgées de 6 à 8 semaines, exemptes d’agents pathogènes spécifiques (FPS) et exemptes d’Helicobacter. Utiliser des animaux ayant un patrimoine génétique C57BL/6 pour des expériences d’infection à H. pylori ou H. felis. Dans la présente étude, nous avons utilisé des souris C57BL/6 de type sauvage (WT) et génétiquement modifiées dépourvues d’un récepteur immunitaire inné clé (appelées animaux knock-out ou KO).
note: Des souris d’autres origines génétiques peuvent également être utilisées pour les infections à Helicobacter, cependant, les niveaux de colonisation et la gravité de la maladie peuvent être influencés par le type d’origine de l’hôte.
- Aspirez l’inoculum bactérien (étape 1.5) dans des seringues jetables de 1 mL et remplacez les aiguilles fournies par des aiguilles de calibre 23 sur lesquelles sont fixés des cathéters jetables en polyéthylène (longueur, 6 à 8 cm ; diamètre intérieur, 0,58 mm). Fixez les cathéters aux aiguilles en appliquant de petites bandes de film plastique (voir le tableau des matériaux). Vous pouvez également remplacer l’ensemble aiguille/cathéter à l’aide de tubes d’alimentation en plastique stériles (calibre 20 x 38 mm).
- Maîtrisez physiquement les souris en les agrippant fermement à la peau du cou et de la queue.
note: Cette procédure peut être réalisée sans anesthésie, ou alternativement, avec l’utilisation d’un anesthésique inhalé, tel que le méthoxyflurane ou l’isoflurane.
- Insérez le cathéter au centre de la mâchoire ouverte et guidez-le dans une direction caudale vers l’œsophage. Étendez le cou de la souris pour faciliter l’accès à l’estomac par l’œsophage (et loin de la trachée) jusqu’à ce que la majeure partie ou la totalité du cathéter ne soit plus visible et qu’une résistance soit ressentie, correspondant à la base de l’estomac. Délivrer une aliquote spécifique, généralement 100 μL par inoculation (Figure 1).
note: Les souris doivent être gavées avec ≥ 105 UFC pour assurer une colonisation optimale et une pathologie de la maladie.
