$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Synthèse SPIO-MtbsAb
- Synthétiser la 2,2'-(éthylènedioxy)biséthylamine (EDBE) conjuguée à SPIO à l'aide de méthodes précédemment indiquées.
- Synthétiser l’anhydride succinique SPIO-EDBE.
- Agiter une solution alcaline (5 M NaOH ; 10 mL)) de SPIO-EDBE et de SA (1 g ; 10 μmol) à température ambiante pendant 24 h.
- Dialyser la solution en 20 changements de 2 L d’eau distillée à l’aide d’un tube à membrane poreuse moléculaire (coupure de 12 000 à 14 000 MW), soit 6 h pour chaque changement.
- Enfin, ajouter 100 μL de SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL de Fe) à 400 μL d’anticorps de surface de Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) de 4,5 mg/mL pour synthétiser SPIO-MtbsAb en utilisant du 1-hydroxybenzotriazole et de l’hexafluorophosphate de tripyrrolidinophosphonium (benzotriazol-1-yloxy) comme catalyseurs et agiter la solution à température ambiante pendant 24 h.
- Enfin, séparez les solutions de l’anticorps non lié par chromatographie par filtration sur gel.
- Chargez le mélange réactionnel (5 ml) sur une colonne de 2,5 cm × 33 cm et éluez à l’aide d’un tampon salin tamponné au phosphate (PBS). Confirmez le complexe Ab-nanoparticules (c’est-à-dire nanosonde) à l’aide d’un kit de dosage de protéines d’acide bicinchoninique.
2. Observation de la morphologie des particules et mesure du niveau de relaxation
- Examinez la taille moyenne des particules, la morphologie et la distribution granulométrique à l’aide d’un microscope électronique à transmission à une tension de 100 kV.
- Coulez la dispersion composite sur une grille de cuivre de 200 mailles et séchez-la à l’air libre à température ambiante avant de la charger sur le microscope.
- Mesurez les valeurs de temps de relaxation (T1 et T2) des nanosondes à l’aide du relaxomètre RMN à 20 MHz et 37,0 °C ± 0,1 °C.
- Calibrez le relaxomètre avant chaque mesure.
- Enregistrez les valeurs r1 et r2 des huit points de données générés par inversion-récupération et la séquence d’impulsions Carr-Purcell-Meiboom-Gill, respectivement, pour déterminer les relaxivités r1 et r2.
3. Imagerie cellulaire
- Cultivez les monocytes humains THP-1 dans le RPMI 1640 avec 10 % de sérum de veau fœtal, 50 μg/mL de sulfate de gentamycine, 100 unités/mL de pénicilline G sodique, 100 μg de sulfate de streptomycine et 0,25 μg/mL de fungizone dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C.
- Incuber des nanosondes SPIO-MtbsAb (2 mM) avec 106 unités formant colonies (UFC) de Mycobacterium bovis BCG préincubées avec 1 × 107 monocytes activés dans des tubes de microcentrifugation (1 mL) dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 1 h.
- Centrifugez les tubes à 200 x g et jetez le surnageant. Redissoudre les granulés dans le milieu (200 μL).
- Balayez les échantillons à l’aide d’une séquence d’impulsions d’écho à gradient rapide (temps de répétition (TR) = 500 ; Temps d’écho (TE) = 20 ; Angle de retournement = 10°) à travers l'IRM 3,0-T pour déterminer la spécificité et la sensibilité de la nanosonde.
4. Inoculation du BCG (Bacillus Calmette-Guérin)
- Reconstituez le vaccin lyophilisé ou le stock bactérien dans le milieu de Sauton, puis diluez le stock avec une solution saline jusqu'à ce qu'il soit correctement dispersé, comme décrit précédemment.
- Inoculer une souche vivante atténuée de M. bovis BCG, obtenue à partir d’ADIMMUNE (Taipei, Taïwan) (souche Connaught ; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) à un volume de 0,1 mL/souris (c.-à-d. 107 UFC) par voie intradermique dans la peau scapulaire dorsale gauche ou droite des souris, comme décrit précédemment. Injectez une solution saline chez les souris comme contrôle négatif. Surveiller quotidiennement les animaux après l’inoculation du BCG.
- Sacrifier les animaux 1 mois après l’inoculation des bactéries par euthanasie au dioxyde de carbone. Prélever le tissu du site d’inoculation intradermique. Fixez le tissu dans du formol à 10 % et incorporez-le dans de la paraffine pour des coupes en série à 5-10 μm. Colorez des coupes de tissus avec les colorants à l’hématoxyline/éosine et Ziehl-Neelsen pour les bactéries acido-résistantes et au bleu de Berlin pour le fer ferrique.
5. IRM in vivo
- Injecter de la kétamine (80 mg/kg de poids corporel) et de la xylazine (12 mg/kg de poids corporel) par voie sous-cutanée à des souris pour une anesthésie animale.
- Injectez des sondes SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μL) dans les veines de la queue de souris. Imagez les souris par IRM avant et immédiatement après l’injection de la sonde, puis toutes les 5 minutes pendant 30 minutes pour acquérir des images d’écho de spin rapide pondérées en T2 (TR = 3000 ; TE = 90 ; champ de vision = 8).
- Analysez quantitativement toutes les images IRM à l’aide de l’intensité du signal (IS), une mesure de régions d’intérêt définies à des endroits comparables d’un centre de granulome Mtb et du muscle dorsal adjacent à une zone granulomateuse.
- Calculez les améliorations relatives du signal à l’aide de la mesure SI avant (SIpre ; contrôle) et 0-3 h après (SIpost) injection des agents de contraste à l’aide de la formule
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
où SIpre est le SI de la lésion sur le balayage pré-amélioré et SIpost est le SI de la lésion sur le balayage post-amélioré.