Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Collecte des granulés fécaux frais
- Préparez des essuie-tout stériles, des pinces à bout émoussé et des tubes coniques de 50 ml.
- Placez des serviettes en papier et des pinces dans des sacs d’autoclave séparés et autoclavez-les à 180 °C à chaleur sèche pendant 30 min. Utilisez également des tubes coniques stériles. Pesez les tubes coniques et notez leur poids sur les tubes.
- Allumez l’enceinte de biosécurité dans la salle des animaux.
- Prenez une cage de souris propre et autoclavée sans aucune litière et placez-la dans l’enceinte de biosécurité. Retirez le couvercle et la grille à aliments et placez-les à l’intérieur de l’armoire.
- Placez des serviettes en papier stériles au fond de la cage et remettez la grille métallique sur le dessus de la cage.
- Identifiez les donneurs de matières fécales du même âge et placez la cage de la souris dans l’enceinte de biosécurité. Ouvrez la cage et saisissez doucement une souris donneuse (C57BL/6J) par la queue et placez-la sur le support métallique au-dessus de la cage propre.
- Placez le couvercle de la cage sur le dessus de la grille et attendez que le ou les animaux défèquent.
REMARQUE : Mettez simultanément quelques compagnons de portée de souris sur le support.
- Recueillir les boulettes fécales et les mettre dans un tube conique stérile de 50 ml. Mettez les granulés en commun par sexe. Ne mélangez pas les boulettes fécales recueillies sur les mâles et les femelles.
- Pesez à nouveau le tube et calculez le poids des boulettes fécales.
2. Préparation de la suspension fécale
- Préparez une solution stérile (10 % de glycérol dans une solution saline normale).
- Ajouter 10 ml de glycérol à 10 % ou de solution saline normale dans le tube conique pour chaque gramme de boulettes fécales.
REMARQUE : Augmentez le volume de la solution à 20 mL si nécessaire. Cette étude a également utilisé 1 mL de solution pour chaque pastille (5-10 mg).
- Homogénéiser le mélange à basse vitesse à l’aide d’un homogénéisateur de paillasse ou d’un mélangeur à l’intérieur d’une hotte pour remettre les matières fécales en suspension (3 X 30 s).
- Filtrez la suspension fécale à travers 2 couches de gaze de coton stérile (10,2 cm x 10,2 cm). Conservez temporairement le filtrat au réfrigérateur jusqu’à 6 h ou emballez-le dans des flacons cryogéniques stériles et conservez-le dans un congélateur à -80 °C.
- Nettoyez soigneusement l’homogénéisateur ou le mélangeur en suivant une procédure standard.
3. Administration de suspension fécale par gavage oral
- Décongeler la suspension fécale congelée sur de la glace si vous utilisez des échantillons congelés. Mélangez la suspension fécale décongelée par vortex.
- Transférez la suspension fécale fraîche ou décongelée dans des seringues de 1 ml.
REMARQUE : Chaque souris recevra un total de 200 μL de suspension fécale, et chaque souris IL-10-/- du groupe témoin recevra 200 μL de 10 % de glycérol/sérum physiologique.
- Pesez les souris et choisissez la bonne taille d’aiguille de gavage et le volume de dosage maximal.
REMARQUE : Pour les souris dont le poids corporel est compris entre 20 et 25 grammes, utilisez une aiguille à gavage incurvée de 20 G 3,81 cm avec une boule de 2,25 mm. Veuillez consulter gavageneedle.com pour plus d’informations.
- Testez l'aiguille du gavage en mesurant la longueur entre le bout du nez de la souris et l'apophyse xiphoïde (bas du sternum). Remplissez la seringue avec 10 % de glycérol/sérum physiologique ou de suspension fécale et éliminez les bulles d’air à l’intérieur de la seringue et de l’aiguille.
REMARQUE : Si l’aiguille est plus longue que la longueur, mettez une marque sur la tige de l’aiguille / tube au niveau du nez. Ne passez pas l’aiguille ou le tube à travers l’animal au-delà de ce point pour éviter la perforation gastrique.
- Placez une cage à souris dans l’enceinte de biosécurité, retirez le couvercle de la cage en plastique et laissez le support métallique en place.
- Attrapez une souris par la queue et placez-la sur le support métallique. Tenez la souris par la queue d’une main et utilisez le pouce et le majeur de l’autre main pour retenir l’animal en saisissant la peau par-dessus les épaules. De cette façon, les pattes avant sont étirées sur le côté, ce qui empêchera les pieds avant de pousser l’aiguille vers l’extérieur. Étendez doucement la tête de l'animal vers l'arrière et maintenez la tête en place d'une main.
REMARQUE : Entraînez-vous à manipuler la souris jusqu’à ce que l’expérimentateur ait une confiance totale avant de passer à l’expérience.
- Placez l’aiguille de gavage sur le dessus de la langue à l’intérieur de la bouche. Avancez doucement le long du palais supérieur jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’œsophage. Passez l’aiguille en douceur en un seul mouvement. Ne forcez pas l’aiguille si une résistance se fait sentir. Retirez l’aiguille et réessayez.
- Une fois que l’aiguille est correctement placée et vérifiée, administrez lentement le matériau en poussant la seringue attachée à l’aiguille. Ne faites pas pivoter l’aiguille et ne poussez pas l’aiguille vers l’avant, ce qui pourrait rompre l’œsophage. Après le dosage, retirez doucement l’aiguille.
- Remettez la souris dans sa cage d’origine. Surveillez l’animal pendant 5 à 10 minutes en recherchant des signes de respiration laborieuse ou de détresse. Surveillez à nouveau les souris entre 12 et 24 h après le FMT.
