1. Génération de cellules souches pluripotentes induites
- Cultivez des fibroblastes humains dans du DMEM complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) dans des plaques à 6 puits.
- Avant de commencer la reprogrammation des fibroblastes, enduire 6 puits de Matrigel et incuber pendant au moins une heure à température ambiante. À 80 % de confluence, retirer le milieu des cultures de fibroblastes et laver une fois avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajouter suffisamment de trypsine-EDTA à 0,25 % pour couvrir toute la plaque et incuber à 37 °C pendant 10 min.
- Une fois que les cellules se sont délogées des puits, ajoutez deux fois plus de DMEM avec 10 % de FBS que celle de trypsine pour éteindre la digestion de la trypsine. Pipetez doucement la suspension cellulaire de haut en bas pour briser les cellules. Comptez le nombre de cellules individuelles à l’aide d’un hémocytomètre.
- Transvasez 7 x 105 cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml et centrifugez la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans une solution d’électroporation. Électroporez les fibroblastes selon les instructions du fabricant. Remettre les cellules en suspension dans 100 μl de tampon d’électroporation et ajouter 1 μg de chaque vecteur épisomal. Cellules électroporatiques avec réglages de 1 650 V, 10 ms et 3 impulsions temporelles.
- Transférer la suspension cellulaire dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complétée par 10 % de FBS et une plaque de 5 x 104 cellules par puits d'une plaque de 6 puits. Incuber les plaques à 37 °C et 5 % de CO2.
- Après 48 heures, retirer le milieu des cultures de fibroblastes transfectées et le remplacer par un milieu mTeSR. Remplacez les milieux de culture tous les jours jusqu’à ce que les colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) soient prêtes à être isolées. Les colonies d’iPSC peuvent être observées après 28 à 35 jours.
- Lorsqu’il est prêt à être isolé, coupez mécaniquement une colonie de CSPi et réensemencez-la dans un milieu mTeSR avec un inhibiteur de la protéine kinase associée à la Rho (ROCK) de 10 μM (Y-27632) sur une plaque à 6 puits recouverte de Matrigel. Remplacez le milieu de culture tous les jours.
2. Induction neuronale et maintien des NPC humains
- Lorsque les cultures iPSC sont à environ 20 % de confluence, supprimer le milieu mTeSR et le remplacer par un milieu d’induction neurale. Réapprovisionnez le milieu tous les deux jours.
- Après 7 jours, retirez le milieu d’induction neurale et remplacez-le par un milieu de maintenance NPC humain. Réapprovisionnez le milieu tous les deux jours jusqu’à 7 jours avant de passer les cultures.
- Avant de passer les cultures, enduire les plaques/flacons de Matrigel à température ambiante pendant au moins une heure.
- Retirez le milieu des cultures humaines confluentes de NPC et lavez-le une fois avec 1x PBS, puis aspirez le PBS.
- Ajouter suffisamment de solution de détachement cellulaire pour couvrir tous les puits, puis incuber pendant 5 min à 37 °C.
- Assurez-vous que toutes les cellules sont détachées. Ajouter deux fois plus de DMEM/F-12 (milieu Eagle modifié/mélange nutritif F-12 de Dulbecco) que celle de la solution de détachement cellulaire dans les puits/flacons.
- Transvaser les cellules contenant du DMEM/F-12 dans un tube à centrifuger de 15 ml et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
- Retirer les cellules surnageantes et les remettre en suspension dans 5 ml de milieu d’entretien NPC humain. Pipetez doucement la suspension cellulaire de haut en bas pour briser les cellules.
- Placez un tiers du total des cellules dans des puits/flacons de culture recouverts de Matrigel et remplissez suffisamment de milieu complété par 10 μM d’Y-27632. Incuber les récipients de culture à 37 °C et 5 % de CO2.
- Divisez les cultures 1:3 tous les 3 à 4 jours et réapprovisionnez le milieu tous les deux jours. Maintenir les cultures humaines de NPC à haute densité pour éviter la différenciation.
3. Différenciation des PNJ humains en neurones dans les co-cultures
- Ajoutez le vecteur lentiviral Synapsin1-tdTomato à une culture de NPC humaine avant d’initier la différenciation en neurones. Préparez des co-cultures astrocytes/neurones corticaux un jour à l’avance avant de différencier les PNJ humains.
- Lavez une fois les cultures humaines de NPC avec 1x PBS et ajoutez suffisamment de solution de détachement cellulaire pour couvrir tous les puits/flacons, puis incubez pendant 5 min à 37 °C.
- Assurez-vous que toutes les cellules sont détachées. Ajouter deux fois plus de DMEM/F-12 que de solution de détachement cellulaire dans les puits/flacons. Transvaser dans un tube à centrifuger de 15 ml. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
- Éliminer les cellules surnageantes et les remettre en suspension dans 5 ml de milieu de différenciation neuronale. Pipetez doucement la suspension cellulaire de haut en bas pour briser la pastille cellulaire en cellules individuelles. Comptez le nombre de cellules individuelles à l’aide d’un hémocytomètre.
- Aspirez soigneusement le milieu des cultures d’astrocytes/neurones corticaux. Plaquez les NPC humains à 5 x 103 cellules/cm2 dans 500 μl de milieu de différenciation neuronale complété par 10 μM d’Y-27632 pour chaque 24 puits. Ajoutez doucement un milieu contenant des PNJ humains dans chaque puits pour éviter de perturber les astrocytes et les neurones corticaux.
- Incuber les plaques à 37 °C et 5 % de CO2. Remplacez la moitié du milieu par du milieu frais tous les deux à trois jours pendant au moins 28 jours.
