L’imagerie calcique dans les neurones individuels régulant le comportement de ponte chez Caenorhabditis elegans

Résumé

Source : Ravi, B. et al., Imagerie calcique ratiométrique des neurones individuels dans le comportement de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre une technique d’imagerie calcique dans des neurones individuels de Caenorhabditis elegans se comportant à l’aide de protéines rapporteures fluorescentes génétiquement codées. Il décrit les étapes impliquées dans l’imagerie du mouvement du ver et la mesure des rapports de fluorescence rapporteure des neurones pour corréler les niveaux de calcium intracellulaire avec l’activité neuronale et les changements de comportement pendant la ponte.

Protocole

1. Souches, milieux de culture et montage des animaux

1. Cultivez des vers C. elegans à 20 °C sur des plaques de gélose standard de 60 mm de milieu de croissance de nématode (NGM) ensemencées avec de la nourriture bactérienne OP50 E. coli.
2. Préparez deux plasmides pour chaque promoteur d’intérêt spécifique à la cellule : l’un, qui pilote l’expression de GCaMP5 pour enregistrer le Ca²⁺ intracellulaire, et le second, qui pilote l’expression de mCherry pour permettre la quantification ratiométrique des changements de fluorescence de GCaMP5 et simplifier la recherche et la mesure d’objets.
   note: L’imagerie ratiométrique GCaMP5 :mCherry corrige les fluctuations de fluorescence de GCaMP5 qui résultent de changements de focalisation et de mouvements d’animaux, et non de changements réels de Ca²⁺ intracellulaire.
3. Injectez des plasmides exprimant GCaMP5 et mCherry ainsi que le plasmide marqueur de sauvetage visible pL15EK dans les gonades d’animaux mutants LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X et récupérez des animaux non-Muv lin-15(+) exprimant GCaMP5 et mCherry à partir d’un transgène à haute copie. Utilisez l’arrière-plan mutant lite-1 pour réduire le comportement d’évitement de la lumière bleue.
4. Intégrer des transgènes aux chromosomes pour réduire le mosaïcisme et simplifier la génération de souches mutantes composées.
   note: La souche LX2004 décrite ici porte un transgène intégré à haute copie qui exprime GCaMP5 et mCherry dans les HSN à partir du promoteur nlp-3 (voir le tableau des matériaux). Il a été constaté que le promoteur nlp-3 entraînait une forte expression dans les HSN des animaux L4 tardifs et adultes sans provoquer de défauts significatifs dans le développement de HSN ou le comportement de ponte par rapport aux autres promoteurs testés (par exemple, tph-1, egl-6 et unc-86). Cette souche et d’autres qui expriment GCaMP5 et mCherry dans les motoneurones de la moelle ventrale (VC), les muscles vulvaires et les cellules neuroendocrines UV1 sont disponibles auprès du Caenorhabditis Genetics Center, et les détails de leur construction ont été décrits.
5. Appliquez de la nourriture bactérienne OP50 à partir d’une plaque de gélose NGM ensemencée au fond d’une pioche à vers de platine et utilisez-la pour transférer ~ 20 animaux L4 LX2004 tardifs qui expriment GCaMP5 et mCherry dans les HSN à partir du promoteur nlp-3. Assurez-vous que la vulve en développement apparaît au stéréomicroscope sous la forme d’une tache sombre claire entourée d’un croissant blanc. Incuber les animaux à 20 °C pendant 24 à 40 h.
6. Après l’incubation, appliquez OP50 sur la cueillette et transférez ~ 3 des vers sur une plaque NGM non ensemencée, en laissant une petite quantité de nourriture derrière eux pour que les vers se nourrissent pendant l’imagerie. Assurez-vous de manger en quantité suffisante, car trop peu de nourriture bactérienne encouragera les vers à s’éloigner du centre de l’assiette, tandis que trop de nourriture augmentera la fluorescence de fond et provoquera une hypoxie.
7. À l’aide d’une spatule plate et arrondie, découpez un morceau de ~ 20 mm x 20 mm dans la plaque portant les vers et transférez le morceau face vers le bas au centre d’une lamelle propre de 24 mm x 60 mm #1.5 (Figure 1). Commencez l’application d’un côté pour éviter que les bulles ne se coincent sous la lamelle et n’interfèrent avec l’imagerie. Appliquez une lamelle #1 de 22 mm x 22 mm sur le dessus du morceau pour réduire l’adhérence et l’évaporation.

2. Configuration du matériel et de l’instrumentation

1. Placez les vers transgéniques étagés sur la platine d’un microscope inversé équipé d’un objectif ≥ 0,7 plan d’ouverture numérique-apochromatique 20x, d’une platine XY motorisée contrôlable à l’aide d’un joystick, d’un séparateur d’image et de filtres de fluorescence pour l’excitation et l’émission simultanées de GCaMP5 et de mCherry, de caméras pour l’imagerie en fluorescence et infrarouge en fond clair et d’un système d’éclairage à diode électroluminescente (LED) déclenchable (Figure 2A).
   REMARQUE : Un séparateur de faisceau 80/20 envoie 80 % du signal d’image à la caméra à fluorescence et 20 % à la caméra à fond clair. Un microscope droit peut également être utilisé, mais le morceau NGM doit être placé entre une lame de verre et la grande lamelle dans ce cas.
   1. Utilisez les oculaires binoculaires pour sélectionner un ver pour l’imagerie. Lorsqu’un animal est sélectionné, faites glisser le filtre infrarouge en place au-dessus du condenseur.
2. Déclencheurs de logique transistor-transistor (TTL)
   1. Fixez des câbles coaxiaux à partir de chacune des trois lignes de sortie de déclenchement TTL sur la caméra de fluorescence. Connectez la première sortie à l’entrée BNC #3 du système d’éclairage LED.
   2. Connectez la deuxième sortie à un adaptateur BNC « banane » avec des fils verts et marron à partir du connecteur GPIO à 8 broches reliant respectivement l'entrée GPIO #3 (broche 4) et la masse (broche 5) de la caméra infrarouge.
   3. Connectez la troisième sortie à un adaptateur BNC « banane » avec des fils de liaison reliant l'entrée numérique #8 et la masse du périphérique d'acquisition numérique (Figure 2B).
3. Dispositif d’acquisition numérique (DAQ)
   1. Connectez la carte du microcontrôleur DAQ (voir la table des matériaux) au PC à l’aide d’un câble USB. Mettez à jour le firmware avec le protocole standard Firmata (voir le tableau des matériaux) et configurez le port USB pour communiquer à 57600 bauds.
4. Led
   1. Exécutez le logiciel du contrôleur LED (voir Tableau des matériaux). Basculez le mode de déclenchement de « Continu » à « Contrôlé » et sélectionnez le canal de déclenchement « 3 » pour les LED de 470 et 590 nm.
   2. Allumez et entrez la puissance de chaque LED (par exemple, réglez la LED 470 nm sur 20 % et la LED 590 nm sur 40 %).
5. Exécutez le script de communication de l'étape en série 'XY-stage-final' en bonsaï (voir la table des matériaux). Cliquez sur le nœud gris « CsvWriter » et sélectionnez un dossier pour enregistrer les informations enregistrées sur les étapes X et Y (Figure 3). Appuyez sur la flèche verte de la barre d’outils pour initialiser le fichier DAQ.
   note: Le script commencera à enregistrer la position des platines X et Y lorsque la caméra de fluorescence enverra un signal TTL. Ce script génère quatre colonnes de données : le numéro de trame, la position X (μm), la position Y (μm) et l’intervalle entre les trames (s).
6. Dans le logiciel d'enregistrement par caméra infrarouge (voir la table des matériaux), sous « Modes vidéo personnalisés », sélectionnez « Mode 1 » (2 x 2 binning ; 1 024 x 1 024 pixels) et « Pixel Format Raw 8 ». Sous « Déclencheur / Stroboscope », réglez la ligne d'entrée de déclenchement (GPIO) sur « 3 », la polarité sur « Élevée » et le « Mode » sur « 14 ». Basculez « Activer » pour arrêter l'acquisition d'images jusqu'à ce qu'un signal de déclenchement TTL soit reçu.
   1. En laissant cette fenêtre ouverte, cliquez sur le bouton rouge « Enregistrer » dans la barre d’outils principale de la caméra. Sélectionnez le dossier dans lequel les séquences d’images doivent être enregistrées. Sélectionnez le mode d'enregistrement « Buffered » et enregistrez les « Images » au format JPEG. Cliquez sur « Démarrer l’enregistrement » pour initialiser l’acquisition.
7. Caméra à fluorescence et séparateur d’images
   note: Les canaux de fluorescence GCaMP5 et mCherry doivent être collectés simultanément pour assurer un recalage correct de l’image pour la quantification ratiométrique. Un séparateur d’image permet l’acquisition sur deux canaux de la fluorescence GCaMP5 et mCherry sur un seul capteur.
   1. Dans l'onglet « Capture » du logiciel d'acquisition d'images (voir Tableau des matériaux), réglez le temps d'exposition sur 10 ms, le binning sur 4x et la profondeur d'image sur 16 bits. Sélectionnez un sous-réseau de caméra centré de 512 pixels de large sur 256 pixels de haut. Cliquez sur « Afficher les options de déclenchement de sortie » et réglez tous les déclencheurs sur « Positif ».
      REMARQUE : Il peut arriver que l’administrateur de données manque des déclencheurs TTL s’ils sont inférieurs ou égaux à 10 ms.
   2. Assurez-vous que « Déclencheur 1 » et « Déclencheur 2 » sont réglés sur « Exposition » tandis que « Déclencheur 3 » est réglé sur « Programmable » avec une « Période » de 25 ms. Sous l'onglet « Séquence », sélectionnez « Time Lapse » avec un « Field Delay1 » de 50 ms pour collecter des images à 20 Hz. Sélectionnez « Enregistrer dans la mémoire tampon temporaire ».
8. Gain PMT et intensité laser pendant l’imagerie confocale à trois canaux
   1. Réglez le gain PMT de sorte que la fluorescence de fond soit à un niveau juste au-dessus du minimum (niveau de noir). Augmentez la puissance laser de 561 nm (vert) jusqu’à ce qu’un seul pixel saturé de 12 bits ou 16 bits soit observé à l’extrémité présynaptique dans le canal mCherry.
   2. Ajustez l’intensité du laser à 488 nm (bleu) de sorte que la fluorescence GCaMP5 soit juste visible à l’extrémité présynaptique au-dessus de l’arrière-plan. Ce réglage faible empêche la saturation des pixels GCaMP5 lorsque la fluorescence augmente en réponse à de forts transitoires Ca²⁺. Ouvrez complètement le sténopé confocal pour maximiser la capture de la lumière.

3. Imagerie ratiométrique Ca²⁺ et enregistrement du comportement

1. Sous l'onglet « Séquence » du logiciel d'acquisition de fluorescence, cliquez sur « Démarrer » pour commencer l'enregistrement. Suivez le ver avec le joystick, en gardant la ou les cellules et les synapses d’intérêt au centre du champ de vision (FOV). Cliquez sur le bouton « Statistiques » dans la fenêtre de l'histogramme pour afficher les statistiques de pixels de chaque canal.
2. Ajustez la puissance de la LED pour assurer une fluorescence mCherry maximale d’un seul pixel à l’extrémité présynaptique de ≥ 8 000 comptes (~ 4 000 photoélectrons), ce qui donne une plage dynamique de ~ 12 bits au-dessus de l’arrière-plan (~ 100 photoélectrons). Les signaux GCaMP5 à l’extrémité présynaptique pendant le repos (faible) Ca²⁺ devraient être d’environ ~ 2 500 comptes - juste visibles au-dessus du fond.
3. Enregistrez jusqu’à ce qu’un état actif de ponte soit atteint ; généralement, cela se produit toutes les 20 à 30 minutes chez un ver de type sauvage. Enregistrez un sous-ensemble de 10 minutes (12 001 images), 6 000 images avant et après le premier événement de ponte (image 6 001). Assurez-vous de conserver le même sous-ensemble d’images en fond clair du comportement du ver et les points temporels de la position de la platine XY, sinon la synchronisation précise des flux de données sera perdue.
4. Utilisez ImageJ et le plug-in BioFormats (voir Table des matériaux) pour convertir les séquences d’images au format .ics standard de cytométrie d’image afin qu’elles puissent être importées dans le logiciel de quantification ratiométrique.

Résultats

Figure 1. Technique de montage de C. elegans pour l’imagerie à haute résolution de l’activité et du comportement du circuit de ponte.En haut, le montage final par le côté. En bas, le montage final vu à travers le bas de la grande lamelle. Les flèches indiquent la nourriture bactérienne OP50, les vers C. elegans et les œufs, pris en sandwich entre le morceau d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Croissance, culture et montaison de C. elegans
souche bactérienne d’Escherichia coli, OP50	Centre Génétique Caenorhabditis	OP50	Nourriture pour C. elegans. Uracil auxotrophe. E. coli B. Niveau de biosécurité 1
HSN GCaMP5+mSouche de ver du cerisier	Centre Génétique Caenorhabditis	LX2004	Transgène intégré utilisant le promoteur nlp-3 pour piloter l’expression de GCaMP5 et mCherry dans HSN. Génotype complet : vsIs183 [nlp-3p ::GCaMP5 ::nlp-3 3'UTR + nlp-3p ::mCherry ::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
Souche mutante LITE-1(CE314), LIN-15(N765TS) pour la préparation de transgènes	auteur	LX1832	Souche pour la récupération de transgènes à haute copie après micro-injection avec le plasmide de secours pL15EK lin-15(n765ts). Porte également la mutation liée lite-1 (ce314) qui réduit la sensibilité à la lumière bleue. Disponible auprès de l’auteur sur demande
Plasmide de secours génomique pL15EK lin-15a/b	auteur	pL15EK	Plasmide de secours pour la récupération d’animaux transgéniques après injection dans LX1832 souche X, lite-1(ce314), lin-15(n765ts). Disponible auprès de l’auteur sur demande
Plasmide pKMC299	auteur	pKMC299	Plasmide pour l’expression de mCherry dans les HSN à partir du promoteur nlp-3. A nlp-3 3' région non traduite
Plasmide pKMC300	auteur	pKMC300	Plasmide pour l’expression de GCaMP5 dans les HSN à partir du promoteur nlp-3. A nlp-3 3' région non traduite
Phosphate de potassium monobasique	sigma	Réf. P8281	Pour la préparation des plaques NGM
Phosphate de potassium dibasique	sigma	Réf. P5655	Pour la préparation des plaques NGM
Sulfate de magnésium heptahydraté	Amresco	662	Pour la préparation des plaques NGM
Chlorure de calcium dihydraté	Alfa Aesar	Référence 12312	Pour la préparation des plaques NGM
Peptone	Becton Dickinson	Référence 211820	Pour la préparation des plaques NGM
chlorure de sodium	Amresco	241	Pour la préparation des plaques NGM
cholestérol	Alfa Aesar	A11470	Pour la préparation des plaques NGM
Gélose bactériologique de type A, ultrapure	Affymetrix	Référence 10906	Pour la préparation des plaques NGM
Boîtes de Pétri de 60 mm	VWR	Référence 25384-164	Pour la préparation des plaques NGM
24 verres micro de 60 mm, #1.5	VWR	Référence 48393-251	Verre de couverture à travers lequel les vers sont imagés
22 x 22 mm micro couvercle, #1	VWR	Référence 48366-067	Verre de couverture qui recouvre le haut du morceau de gélose
Stéréomicroscope avec base de lumière transmise	Leica	M50	Microscope de dissection pour l’entretien, la stadification et le montage des souches de vers
Fil de platine iridium, (80:20), 0,2 mm	ALFA AESAR	AA39526-BW	Pour le transfert de vers sans fin
Microscope à imagerie calcique
Table à air anti-vibration	TMC	Référence 63-544	Table de laboratoire Micro-g' Table anti-vibration 30 » x 48 » avec CleanTop M6 de 4 » sur le dessus de 25 mm
Microscope composé inversé	Zeiss	Tél. : 431007-9902-000	Microscope inversé Axio Observer.Z1
Sideport L80/R100 (3 positions)	Zeiss	Référence 425165-0000-000	Pour détourner 20 % de la sortie vers une caméra à fond clair (CMOS), 80 % vers une caméra à fluorescence (sCMOS)
Support d’éclairage inclinable vers l’arrière	Zeiss	Référence 423920-0000-000	Pour l’imagerie infrarouge/comportementale
Boîtier de lampe 12V/100W avec collecteur	Zeiss	Tél. : 423000-9901-000	Pour l’imagerie infrarouge/comportementale
Lampe halogène 12V/100W	Zeiss	Référence 380059-1660-000	Pour l’imagerie infrarouge/comportementale. Les LED à lumière blanche n’émettent pas de lumière infrarouge significative, elles ne permettent donc pas l’imagerie en fond clair après le filtre passe-bande infrarouge
Filtre passe-bande infrarouge 32 mm (750-790 nm) pour lampe halogène	Zeiss	Référence 447958-9000-000	BP 750-790 ; DMR 32mm, pour l’éclairage infrarouge pour le fond clair et le comportement
Tourelle de condenseur à 6 filtres (LD 0.55 H/DIC/Ph), motorisée	Zeiss	Référence 424244-0000-000	Pour l’imagerie infrarouge/comportementale
Condenseur et obturateur	Zeiss	Référence 423921-0000-000	Pour l’imagerie infrarouge/comportementale
Oculaire binoculaire avec phototube pour caméra CMOS infrarouge	Zeiss	Référence 425536-0000-000	Pour l’imagerie infrarouge/comportementale
Oculaire 10x, 23mm	Zeiss	Référence 444036-9000-000	Pour la localisation des vers sur le morceau de gélose
Adaptateur monture C 2/3" 0,63x	Zeiss	Référence 426113-0000-000	Support pour caméra CMOS infrarouge
Caméra CMOS pour le fond clair infrarouge et le comportement (capteur 1")	FLIR (anciennement Point Grey Research)	GS3-U3-41C6NIR-C	Appareil photo pour l’imagerie en fond clair
Carte contrôleur hôte USB 3.0	FLIR (anciennement Point Grey Research)	ACC-01-1202	Fresco FL1100, 4 ports
8 broches, câble GPIO de 1 m, connecteur circulaire Hirose HR25	FLIR (anciennement Point Grey Research)	ACC-01-3000	Câble pour le déclenchement TTL. Le fil vert se connecte à GPIO3 / Broche 4 et le fil marron se connecte à la terre / Broche 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27	Zeiss	Tél. : 420650-9901-000	Meilleure combinaison de grossissement, d’ouverture numérique et de distance de travail
Tourelle réflecteur 6 cubes, motorisée	Zeiss	Référence 424947-0000-000	Pour l’imagerie par fluorescence
Train de lumière à fluorescence, motorisé	Zeiss	Référence 423607-0000-000	Pour l’imagerie par fluorescence
Obturateur de fluorescence	Zeiss	Référence 423625-0000-000	Pour l’imagerie par fluorescence
Cube de filtre à double excitation et émission GFP et mCherry (pour microscope)	Zeiss	Référence 489062-9901-000	FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed pour l’imagerie par fluorescence
Système d’éclairage LED	Zeiss	Tél. : 423052-9501-000	Système LED Colibri.2 déclenchable pour l’éclairage fluorescent
Module LED GFP (470 nm)	Zeiss	Tél. : 423052-9052-000	LED Colibri.2 pour l’excitation de fluorescence GFP
Module LED mCherry (590 nm)	Zeiss	Tél. : 423052-9082-000	LED Colibri.2 pour l’excitation par fluorescence mCherry
Glissière d’arrêt d’iris pour équipement d’éclairage incident	Zeiss	Référence 000000-1062-360	Iris d’ouverture de champ pour limiter l’éclairage LED au champ de vision de la caméra
Adaptateur monture C 1" 1.0x	Zeiss	Référence 426114-0000-000	Adaptateur pour séparateur d’images et caméra à fluorescence sCMOS
Séparateur d’images	Hamamatsu	Référence A12801-01	Gemini W-View, d’autres séparateurs d’images peuvent être utilisés, mais ils peuvent ne pas être optimisés pour la grande taille du capteur des caméras sCMOS
Miroir dichroïque GFP / mCherry (séparateur d’image)	Semrock	Di02-R594-25x36	Séparation du GCaMP5 à partir de mCherry et des signaux infrarouges
Filtre d’émission GFP (séparateur d’image)	Semrock	Référence : FF01-525/30-25	Capture de la fluorescence GCaMP5
mCherry/filtre d’émission (séparateur d’image)	Semrock	Référence : FF01-647/57-25	Ce filtre est nécessaire pour exclure la lumière infrarouge utilisée pour l’imagerie en fond clair
Caméra sCMOS pour fluorescence (capteur 1")	Hamamatsu	A12802-01 / C11440-22CU	Orca FLASH 4.0 V2. Les modèles plus récents permettent des paramètres d’acquisition d’images séparés sur des moitiés distinctes du capteur, ce qui permet l’acquisition d’images à deux canaux en combinaison avec un séparateur d’images
Platine XY motorisée	Märzhäuser	BALAYAGE IM 130 x 100	Mouvement de la platine ; la résolution XY de cette platine est de 0,2 μm par pas
Contrôleur XY Stage avec joystick	LUDL	MAC6000, joystick XY	Suivi manuel des vers. MAC6000 contrôleur doit être connecté au PC via le port série (RS-232) configuré sur 115200 bauds
Carte d’acquisition numérique (DAQ)	Arduino	ONU	Réception des déclencheurs TTL de la caméra sCMOS. L’Uno doit être chargé avec le package standard Firmata, et le port USB de l’ordinateur configuré à 57600 bauds
Câble BNC mâle vers BNC mâle - 6 pi	Technologie Hosa	HOBB6	Connecteurs BNC pour le déclenchement TTL
Câble coaxial BNC mâle vers SMA mâle plaqué or (8,8	uxcell	6.08642E+11	Pour connecter les sorties de déclenchement de la caméra à fluorescence
Adaptateur de tête de rotation BNC	Hantek	RRBNCTH21	Adaptateur BNC vers fiche banane (4mm)
Connecteur BNC femelle à femelle	Diageng	20130530009	Adaptateur BNC femelle à femelle pour connecter la sortie BNC de l’appareil photo à la prise banane
Fils de liaison flexibles pour plaque d’essai sans soudure	Z&T	GK1212827	Pour connecter les sorties de déclenchement BNC à l’ADQ Arduiono. Mâle à mâle.
Station de travail haute performance	CV	Réf. Z820	Windows 7, 64 Go de RAM, double processeur Xeon, disque SSD C :, port série (RS-232), plusieurs emplacements PCIe3 pour la connectivité Ethernet, cartes USB 3.0 et disques SSD supplémentaires
M.2 Disque SSD	Samsung	MZ-V5P512BW	Streaming et analyse des données d’image à haut débit
Adaptateur de disque SSD M.2 pour postes de travail	Lycom	DT-120	Adaptateur M.2 vers PCIe 3.0 4 voies
Stockage en réseau	Synologie	DS-2415+	Stockage et analyse des données d’imagerie
Disques durs	Numérique occidental	WD80EFZX	ROUGE 8 To, 5400 tr/min Classe SATA 6 Gb/s 128 Mo de cache 3,5 pouces. Stockage des données d’imagerie (10 disques + 2 disques redondants)
logiciel
Acquisition de fluorescence	Hamamatsu	HCImage DIA	Enregistrement de séquences d’images de fluorescence à deux canaux (GCaMP5 et mCherry) à 20 ips
Acquisition de Brightfield	FLIR (anciennement Point Grey Research)	Capture de mouches	Enregistrement de séquences d’images JPEG en fond clair
Lecteur de port série de scène	bonsaï	https://bitbucket.org/horizongir/bonsai	Facilite le suivi des vers pendant le comportement
Logiciel de contrôleur LED	Zeiss	Test de la Micro Toolbox 2011	Pour configurer l’intensité et les entrées de déclenchement des différentes LED de l’unité Colibri.2
ImageJ	Nih	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Révision simple des séquences d’images et des modifications de formatage pour l’importation dans le logiciel de quantification ratiométrique
exceller	Microsoft	Référence 2002984-001-000001	Pour générer des sous-ensembles de données de valeurs séparées par des virgules à partir de Volocity pour l’analyse MATLAB
Recherche de pic	MATLAB	R2017a	Script utilisé pour les calculs de fonction de crête de rapport
Quantification ratiométrique	Perkin Elmer	Volocité 6,3	Facilite le calcul des canaux d’image ratiométriques, la segmentation d’image pour la recherche d’objets et la mesure du rapport des objets trouvés
Scripts
AnalyzeGCaMP_2017 heures	MATLAB	Rapport moyen et script de centroïde XY	Analyse une sortie ratiométrique au format .csv, en consolidant les objets et les positions des centroïdes, en calculant les changements de rapport (ΔR/R), en identifiant les pics et les caractéristiques des pics et en écrivant des tracés (avec et sans pics annotés) au format postscript. Pour l’importation de fichiers matriciels, le script génère des données dans trois dossiers : analysé, pics et traces. La sortie 'Analysée' est un fichier matriciel des objets consolidés avec six colonnes (unités) : temps (s), aire (microns carrés), rapport, centroïde X (microns), centroïde Y (microns) et ΔR/R. La sortie 'Peaks' est un fichier matriciel des points temporels des pics trouvés, de l'amplitude (en ΔR/R), de la largeur du pic (s), et la proéminence du sommet. Les sorties 'Traces' sont des fichiers post-scriptum de traces de calcium.
XY-stage-final.bonsaï	bonsaï	Lecteur de port série DAQ et platine déclenché par TTL	Enregistre la position des étages X et Y (en microns) lorsque l’Arduino connecté reçoit un signal TTL positif de la caméra sCMOS pendant l’exposition de l’image. Le script écrit un fichier .csv avec quatre colonnes : numéro d’image, position X (microns), position Y (microns) et temps écoulé entre les images (généralement ~50 ms lors d’un enregistrement à 20 ips). Les positions X et Y de cette sortie (colonnes 2 et 3, respectivement) sont ajoutées aux positions du centroïde X et Y de l’AnalyzeGCaM