Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation du liquide céphalo-rachidien artificiel standard (LCRa)
- Préparation de la solution mère A
- Ajoutez 700 ml d’eau distillée dans un bécher propre de 1 L avant d’ajouter des produits chimiques.
- Tout en agitant continuellement un volume de 500 ml, ajoutez 136,75 g de NaCl, 6,99 g de KCl, 2,89 g de MgSO4 et 2,83 g de NaH2PO4.
- Ajoutez plus d’eau distillée pour atteindre un volume final de 1 L. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de 117 mM de NaCl, 4,69 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO4 et 1,18 mM de NaH2PO4.
- Conserver au réfrigérateur à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparation de la solution mère B
- Ajoutez 700 ml d’eau distillée dans un bécher propre de 1 L avant d’ajouter des produits chimiques.
- Tout en remuant continuellement un volume de 500 ml, ajoutez 41,45 g de D-glucose et 41,84 g de NaHCO3.
- Ajoutez plus d’eau distillée pour atteindre un volume final de 1 L. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de 11,5 mM de D-glucose et de 24,9 mM de NaHCO3.
- Conserver au réfrigérateur à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Avant chaque expérience, mélanger 50 ml de la solution mère A avec 50 ml de la pâte B et porter à 1 L avec de l’eau distillée pour obtenir la concentration finale d’une solution de LCR et laisser à RT tout en l’oxygénant continuellement avec du carbogène (mélange 95 % O2 - 5 % CO2) pendant au moins 30 min. Préparer la concentration finale dans le LCR uniquement au début de chaque expérience et jeter à la fin de la journée.
2. Préparation du saccharose-liquide céphalo-rachidien artificiel (saccharose-aCSF)
- Préparation de la solution mère C
- Ajoutez 700 ml d’eau distillée dans un bécher propre de 1 L avant d’ajouter des produits chimiques.
- Tout en agitant continuellement 500 ml d’eau distillée, ajoutez 240 g de saccharose, 6,55 g de NaHCO3, 0,671 g de KCl, 4,88 g de MgCl2, 0,22 g de CaCl2 et 0,21 g d’acide ascorbique.
- Ajoutez plus d’eau distillée pour atteindre un volume final de 1 L. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de 701,1 mM de saccharose, 78 mM de NaHCO3, 9 mM de KCl, 24 mM de MgCl2, 1,5 mM de CaCl2 et 1,2 mM d’acide ascorbique.
- Conserver la solution mère C à 4 °C jusqu’à une semaine.
- Avant chaque expérience, mélanger 300 ml de 50 ml de substance C avec 600 ml d’eau distillée pour obtenir la solution de saccharose-aCSF à la concentration finale. Laisser à RT tout en l’oxygénant continuellement avec du carbogène (mélange 95 % O2 - 5 % CO2) pendant au moins 30 min.
3. Préparation des tranches
- Placer un bécher propre avec 100 ml de solution de saccharose-aCSF dans de la glace tout en l’oxygénant avec du carbogène et fixer le pH à 7,4 à l’aide d’un pH-mètre tout en ajoutant quelques gouttes de solution de NaOH 0,1 M (lorsque le pH < 7,4) ou de solution HCl 0,1 M (lorsque le pH > 7,4).
- Remplissez une chambre de coupe d’un vibratome avec du saccharose-aCSF et oxygénez-le. Allumez le système de réfrigération à base de glycérol couplé à la chambre de coupe et attendez 15 min pour le laisser refroidir à 0 - 4 °C.
- Anesthésier des ratons (âgés de 9 à 12 ans de rats Sprague-Dawley adultes gestantes) avec de la kétamine (70 mg/kg, i.p. ; en utilisant < volume final de 50 μl). Lorsque le chiot est calme, vérifiez que le réflexe de pincement de la queue est absent.
- Décapitez les chiots.
- Coupez la peau de la tête longitudinalement de l’avant vers l’arrière à l’aide d’une lame de scalpel en acier au carbone et tirez la peau sur les côtés à l’aide d’une pince. Coupez l’os recouvrant le cerveau, déplacez les ciseaux latéralement et retirez-le complètement pour exposer le cerveau.
- Ensuite, retirez rapidement le cerveau à l’aide d’une spatule (initialement placée sous le bulbe olfactif pour le pousser doucement hors des zones les plus rostrales vers les zones les plus caudales). Poussez doucement le cerveau dans du saccharose-liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné refroidi par de la glace (saccharose-aCSF).
- Faites une coupe parasagittale sur l’hémisphère droit (en enlevant environ un tiers de l’hémisphère) et collez le côté coupé du cerveau sur un disque métallique qui sera fixé magnétiquement à la chambre de coupe d’un vibrotrancheur pour couper des sections sagittales de 400 μm contenant le noyau pédonculopontin (PPN). Conservez les tranches PPN à RT pendant 45 minutes avant d’effectuer des enregistrements par patch-clamp sur cellules entières.
4. Enregistrements des oscillations en bande gamma dans les tranches PPN
- Préparation d’une solution intracellulaire de gluconate de potassium (solution à haute teneur en K+)
- Placez dans de la glace un bécher propre avec 10 ml d’eau distillée. Tout en remuant continuellement, ajoutez : K+-gluconate, 90,68 mg de phosphocréatine di Tris sel, 47,66 mg HEPES, 1,5 mg EGTA, 40,58 mg Mg2+-ATP et 4 mg Na+2-GTP.
- Ajustez le pH à 7,3 avec du KOH (100 mM dans de l’eau distillée). Ajouter de l’eau distillée pour atteindre un volume final de 20 mL. Si nécessaire, ajustez l’osmolarité avec du saccharose (100 mM dans de l’eau distillée) à 280 - 290 mOsm. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de 124 mM de K+-gluconate, 10 mM de phosphocréatine de sel de Tris, 10 mM d’HEPES, 0,2 mM d’EGTA, 4 mM deMg 2+-ATP et 0,3 mM de Na+2-GTP.
- Aliquote des solutions intracellulaires dans des tubes de 1 ml et congélation à -20 °C. Utiliser une aliquote par jour et conserver à 4 °C pendant les expériences.
- Enregistrements Patch Clamp à cellules entières
- Placer les tranches dans une chambre d’immersion et les perfuser (1,5 ml/min) avec du LCRa oxygéné (95 % O2 - 5 % CO2) contenant les antagonistes récepteurs suivants : antagoniste sélectif des récepteurs NMDA 2-amino-5-phosphonovalérique (APV, 40 μM), antagoniste compétitif des récepteurs du glutamate AMPA/Kainate 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX, 10μM), antagoniste des récepteurs de la glycine strychnine (STR, 10 μM), l’antagoniste spécifique du récepteur GABAA, la gabazine (GBZ, 10 μM), et la tétrodotoxine, un inhibiteur des canaux sodiques (TTX, 3 μM)
Remplissez les pipettes patch d’enregistrement (résistance 2-7 MΩ ; fabriquées à partir de capillaires en verre borosilicate à paroi épaisse réguliers disponibles dans le commerce de 1,0 mm de diamètre extérieur et de 0,6 mm de diamètre intérieur) avec une solution intracellulaire à haute teneur en K+ à l’aide de remplisseuses de pipettes patch disponibles dans le commerce avec un filtre de solution. Insérez la pipette dans le support de son amplificateur. Appliquez une petite pression positive à l’aide d’une seringue de 1 ml reliée au porte-pipette à l’aide d’un tube en silicone relié à une valve à trois voies. Connectez l’arrière du support de pipette à un amplificateur de patch clamp.
- Déplacez la pipette enregistreuse à l’aide d’un micromanipulateur mécanique près du noyau PPN à l’aide d’un objectif 4X combiné à une optique de contraste interférentiel différentiel dans le proche infrarouge.
note: Le noyau PPN peut être observé en tranches dorsales au pédoncule cérébelleux supérieur (SCP ; observable sous la forme d’un épais faisceau d’axones). Les pipettes enregistreuses ont été localisées dans la pars compacta du PPN, qui est située immédiatement dorsale à l’extrémité postérieure du pédoncule.
- Mettez la pipette d’enregistrement en contact avec un neurone PPN tout en visualisant à l’aide d’une lentille d’immersion dans l’eau 40X, et appliquez rapidement une aspiration négative pour former un joint avec la cellule.
- Utilisez le logiciel de serrage de tension pour surveiller la résistance de la pipette lors de l'aspiration négative à l'aide du protocole du fabricant.
- Lorsque l’aspiration négative est lentement augmentée et que les valeurs de résistance lues par le moniteur patch-clamp à l’extrémité de la pipette atteignent 80 à 100 MOhm, modifiez rapidement le potentiel de maintien à -50 mV et relâchez la pression négative. Commencez à appliquer continuellement une aspiration négative jusqu'à ce que la membrane du neurone se rompe et que l'accès électrique soit réalisé dans la configuration de la cellule entière.
- Si les valeurs de résistance d’accès mesurées par le logiciel de serrage de tension sont de 10 MOhm ou plus, continuez à appliquer une aspiration négative en petites quantités.
- Compensez la capacité (c’est-à-dire les transitoires lents et rapides observés après la rupture de la membrane de la cellule) et la résistance série en mode pince de tension. Basculez le mode d’enregistrement sur la pince de courant et compensez rapidement les valeurs du pont (par exemple, déplacez le bouton de l’amplificateur ou cliquez sur le menu de compensation automatique à l’aide de la souris de l’ordinateur).
- Surveillez en permanence le potentiel de membrane au repos du neurone PPN enregistré à l'aide du protocole du fabricant. Si le potentiel de la membrane au repos se décale vers des valeurs dépolarisantes ou hyperpolarisantes, utilisez de petites quantités de courant continu (jusqu’à 100 pA) pour maintenir la valeur finale optimale de -50 mV.
note: Ne conservez que les neurones PPN dont le potentiel de membrane au repos (RMP) stable est de -48 mV ou plus hyperpolarisé (c’est-à-dire RMP < -48 mV).
