$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Fabrication de casques avec deux électrodes bipolaires (Figure 1)
- Coupez 3,5 cm de fil d’acier inoxydable revêtu de polytétrafluoroéthylène.
- Dénudez environ 1 mm de la couche isolante du fil aux deux extrémités. N’ayez pas trop de fil dénudé.
- Placez deux goupilles sur un support d’étau avec la partie inférieure de la goupille qui a une fente plus longue vers le bas.
- Appliquez du flux sur les extrémités dénudées du fil et sur le dessus des broches.
- Étamez la partie dénudée du fil avec juste assez de soudure pour l’enrober.
- Ajoutez une quantité minimale de soudure sur le haut de la broche sans déborder sur les côtés.
- Placez une extrémité des extrémités dénudées du fil dans la broche aussi profondément que possible pendant que la soudure est fondue.
note: Il y a un trou latéral où le fil peut sortir - ne laissez pas le fil sortir de la broche. Tout le fil dénudé doit rester à l’intérieur de la broche.
- Répétez les étapes 1.6-1.7 pour la deuxième broche, maintenant avec les autres extrémités dénudées du fil.
- Laissez les goupilles reposer pendant 30 secondes pour qu’elles durcissent, retirez-les du support de l’étau, puis tirez dessus pour vous assurer que la connexion entre le fil et les goupilles est solide et tient.
- Rincez les broches à l’eau froide, puis séchez-les.
- Vérifiez la conductance entre la broche 1 et la broche 2 à l’aide d’un ohmmètre.
- Rapprochez les broches aux extrémités du fil, tenez-les parallèlement et fermez-les. Fixez un hémostat au centre du fil. Ensuite, faites pivoter l’hémostat, de sorte que le fil se torde sur lui-même assez serré. Retirez l’hémostat.
- Fixez une pince sur le fil torsadé à 2 mm sous les broches et pliez le fil à 90°.
- Poussez à nouveau le même fil à 90° sur la pince en créant une autre courbure à 1 mm du premier.
- Coupez le fil torsadé à un angle de 45° sous le pli à 3,5 mm avec de petits ciseaux tranchants.
- Préparez deux de ces électrodes bipolaires (torsadées à double broche) pour chaque casque (facultatif, la seconde est de secours en cas de problèmes électriques avec le premier).
- Préparez une seule électrode de référence en coupant en deux un fil avec des broches soudées aux deux extrémités (étapes 1.1-1.17, Figure 1A).
- Coupez le fil à 7 mm.
- Pliez l’extrémité à 1 mm sous la pointe.
- Ensuite, couvrez la pointe pliée de 1 mm du fil avec une pince et tournez le fil autour de la pince pour créer une petite boucle (1 mm de diamètre).
- Pliez la boucle perpendiculairement à la partie droite du fil pour que la pointe du fil pointe à nouveau vers l’extérieur.
- Assemblez les deux électrodes bipolaires et l’électrode de référence unique dans le socle à six broches de manière à ce que les électrodes bipolaires soient côte à côte, à une distance de 6 mm entre elles, et que l’électrode de référence soit placée dans le trou extérieur du milieu (Figure 1B).
note: Une autre méthode consiste à implanter les électrodes, à les cimenter en place, puis à insérer leurs broches dans le piédestal.
2. Implantation d’électrodes stéréotaxiques
- Stérilisez tous les outils chirurgicaux et l’ensemble d’électrodes à six broches par autoclave avant la chirurgie. Un champ chirurgical stérile doit être maintenu pendant l’intervention chirurgicale et des gants chirurgicaux stériles doivent être utilisés. Il est recommandé d'utiliser des champs stériles (p. ex., Press n'Seal) pour couvrir l'animal, à l'exception de la zone chirurgicale.
- Utiliser des souris VGAT-Cre âgées de 8 semaines (exprimant la Cre recombinase sous le contrôle du gène vésiculaire du transporteur GABA [VGAT], appariées selon l’âge, mâles et femelles) pour des chirurgies 4 semaines après le sevrage. Enregistrer le poids de l’animal avant l’intervention chirurgicale pour permettre la mesure de la perte de poids post-chirurgicale.
- Utilisez un vaporisateur isoflurane certifié ou un système d’anesthésie à faible débit équipé d’une pompe à seringue de précision, d’un vaporisateur numérique intégré et d’un coussin chauffant à rétroaction.
note: Les systèmes à faible débit sont capables d'administrer l'anesthésie à de faibles débits proportionnels à la taille de l'animal dans une chambre d'induction ou à travers un cône nasal sur le cadre stéréotaxique (70 mL/min, la concentration d'isoflurane dans l'air est de 4 % pour l'induction et de 2 % pour la chirurgie). L'utilisation de moins d'anesthésie profite non seulement à l'animal pendant les chirurgies, mais réduit également le risque d'exposition du personnel de laboratoire à l'isoflurane.
- Placez l’animal anesthésié sur un coussin chauffant chauffé à 37 °C pour le garder au chaud pendant l’opération. Si vous utilisez un système de température contrôlé par rétroaction, insérez la sonde de température légèrement lubrifiée dans le rectum de l’animal pour surveiller la température pendant l’opération.
- Montez l’animal sur le cadre stéréotaxique en plaçant doucement les barres d’oreille dans les oreilles et les dents supérieures avant dans la barre d’incisive. Placez le cône nasal sur le nez pour une anesthésie correcte. Assurez-vous que la tête est nivelée et centrée et qu’elle ne peut pas être déplacée lorsqu’elle est légèrement sondée.
- Injecter par voie sous-cutanée 0,5 mL de normosol pour l’hydratation.
- Appliquez un lubrifiant oculaire pour prévenir le dessèchement de la cornée.
- Surveiller la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de retrait après le pincement d’un orteil postérieur, puis diminuer l’isoflurane à 1,5 % à 2,0 % pendant la chirurgie.
- Épilez les poils au niveau et autour de la zone chirurgicale à l’aide d’une pince ou d’une tondeuse (rasage) ou d’une crème dépilatoire et désinfectez la peau avec trois cycles d’application alternée d’iode et d’éthanol, en terminant par de l’iode. L’épilation loin du site chirurgical n’est recommandée que s’il existe des moyens de maintenir l’anesthésie à cet endroit. Si nécessaire, utilisez des applicateurs à embout en coton imbibé d’alcool pour enlever les poils de la zone immédiate entourant la tête. Injecter 0,05 mL de l’analgésique local bupivacaïne (0,25 %) par voie sous-cutanée.
- Faites une incision sur le crâne à l’aide d’un scalpel, puis découpez une partie de la peau avec des ciseaux chirurgicaux tranchants, exposant le crâne. En poussant la peau de côté, à l’aide d’un coton-tige, nettoyez le crâne de tous les muscles et tissus sous-jacents obstruant la vue.
note: Pour arrêter le saignement accidentel, appliquez une pression sur le site de saignement avec un coton-tige stérile jusqu’à ce qu’il s’arrête.
- Nettoyez le crâne avec du peroxyde d’hydrogène à l’aide de cotons-tiges stériles pour rendre visibles les sutures du crâne et les bregma et lambda.
- Séchez soigneusement le crâne, puis appliquez une goutte d’adhésif dentaire automordançant à l’aide de son applicateur. Brossez-le dans le crâne, attendez 60 s et polymérisez avec une lumière UV dentaire pendant 40 s. Une surface brillante indique que l’adhésif a été efficacement réticulé avec le crâne.
note: Cette étape est essentielle pour une fixation sécurisée du casque.
- À l’aide d’un foret de 0,031 po (0,79 mm), percer deux trous de fraise bilatéralement pour l’implantation d’électrodes de profondeur de l’hippocampe (environ 5 000 tr/min). Percez un trou de bavure supplémentaire pour l’électrode de référence au-dessus du cervelet derrière le lambda.
REMARQUE : Lors du forage, veillez à abaisser lentement la perceuse et évitez de percer dans le cerveau.
- Les coordonnées des électrodes sont les suivantes (à partir de bregma en mm) : électrodes de l’hippocampe à 3 mm en arrière, 3 mm à l’horizontale et 3 mm de profondeur ; et électrode de référence cérébelleuse à 6 mm en arrière, 0 mm à l’horizontale et 0 mm à la profondeur (sous-durale).
- Pour augmenter la précision, utilisez une perceuse montée stéréotaxique, mettez à zéro l’axe X/Y du manipulateur stéréotaxique lorsque vous touchez le bregma - c’est le point de référence pour les coordonnées.
- Assemblez un casque en insérant toutes les électrodes dans le socle à six broches, en vous assurant que les broches sont enfoncées à fond dans le piédestal. Montez le socle dans le porte-électrode sur un cadre stéréotaxique (Figure 1B).
- Alignez les électrodes au-dessus des trous de bavure correspondants. Implantez stéréotaxiquement des électrodes bipolaires torsadées en acier inoxydable dans l’hippocampe droit et gauche et l’électrode de référence dans le cervelet en abaissant lentement le casque et en guidant les électrodes dans les trous de bavure.
- Lorsque l’électrode de torsion de l’hippocampe se trouve juste au-dessus du trou, mettez à zéro l’axe Z et abaissez-le lentement à -3,0 mm.
- Couvrez la surface du crâne et les électrodes avec du ciment dentaire et remplissez l’espace entre la surface du crâne et le bas du piédestal. Les bords de la peau seront adjacents au ciment dentaire, de sorte qu’aucun tissu sous-jacent ne restera exposé. Attendez que le ciment sèche et durcisse. Détachez ensuite le porte-électrode du bras stéréotaxique et retirez le support du piédestal.
- Injecter 0,1 mL de kétoprofène (1 mg/mL, par voie sous-cutanée) pour l’analgésie et une deuxième dose de 0,5 mL de normosol (SC) pour l’hydratation et retirer l’animal du cadre stéréotaxique.
- Placez un tampon isotherme préchauffé à 37 °C à l’intérieur d’une cage de vivarium vide recouverte d’un essuie-tout. Une fois qu’il est complètement réveillé, placez l’animal dans une cage propre avec de la litière et de la nourriture molle, et remettez-le dans le vivarium. À partir de ce moment, les animaux sont logés individuellement pour éviter de mâcher les casques des autres. Les trémies à barres métalliques ne sont pas utilisées pour éviter que les casques ne se coincent, et au lieu de cela, les bouteilles d’eau sont attachées au dessous des dessus des cages, et la nourriture est présente dans la litière.
- Donnez à l’animal de la nourriture molle pendant 72 heures après la chirurgie et surveillez la perte de poids et l’état corporel. Les animaux déshydratés peuvent recevoir 0,5 mL de normosol par voie sous-cutanée s’ils sont déshydratés (perte de poids, augmentation de la turgescence cutanée, yeux enfoncés). Le kétoprofène peut être administré par voie sous-cutanée une fois par jour pendant 2 jours supplémentaires après la chirurgie (suivez le régime d’analgésie conformément aux directives du comité institutionnel local de soins et d’utilisation des animaux [IACUC]). Laissez les animaux se rétablir complètement dans leur cage pendant 4 à 7 jours avant d’être transférés vers le système d’enregistrement par électroencéphalographie (EEG).
