Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation de la solution expérimentale et de l’équipement pour l’enregistrement sur réseau multiélectrodes
- Préparez du liquide céphalo-rachidien artificiel (liquide céphalo-rachidien artificiel [aCSF] ; 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 1 mM NaH2PO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3 et 10 mM de glucose, bulles avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2).
- Utilisez deux types de sondes MEA : 6 x 10 MEA planes et 8 x 8 MEA. La première sonde couvre la région qui comprend le cortex, le striatum et le thalamus. Cette dernière sonde ne couvre que la région corticale.
- Utilisez un amplificateur à 60 canaux avec un filtre passe-bande réglé entre 0,1 Hz et 3 kHz à une amplification de 1 200. Acquérez des données à une fréquence d’échantillonnage de 10 kHz.
- Placez deux fils d’argent recouverts d’AgCl à l’intérieur de la chambre MEA pour le DCS. Utilisez les fils d’argent recouverts d’AgCl pour produire des champs électriques générés par un stimulateur isolé.
- Placez une électrode en tungstène (diamètre, 127 μm ; longueur, 7,62 cm ; pointe conique 8° AC ; résistance, 5 MΩ) pour la stimulation thalamique, et placez l’électrode de référence dans la chambre MEA. Délivrez les courants de l'électrode de tungstène à l'aide d'un stimulateur isolé contrôlé par un générateur d'impulsions.
2. Préparation de la tranche de cerveau
- Utilisez des souris mâles C57BL/6J âgées de 4 à 8 semaines. Hébergez les animaux dans une pièce climatisée (21-23 °C ; 50 % d’humidité ; cycle lumière/obscurité 12 heures/12 heures, lumières allumées à 8h00) avec accès libre à la nourriture et à l’eau.
- Prenez une aliquote de 250 ml de l’aCSF qui a été préparée à l’étape 1.1 et placez-la dans un bécher contenant de la glace. Dans le même temps, fournir un gaz continu composé de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2.
- chirurgie
- Anesthésier l’animal avec de l’isoflurane à 4 % dans une boîte en verre pendant environ 3 min. Une fois que l’animal atteint une profondeur chirurgicale d’anesthésie (indiquée par l’absence de réponse au pincement des orteils), placez-le sur un plateau peu profond rempli de glace pilée et retirez la tête à l’aide de ciseaux.
- Exposez le crâne et coupez le muscle restant. Ensuite, à l’aide de rongeurs, décollez la surface dorsale du crâne du cerveau. Coupez les côtés du crâne à l’aide de rongeurs. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux avec une solution d’éthanol à 75 %.
- À l’aide d’une spatule, coupez les bulbes olfactifs et les connexions nerveuses le long de la surface ventrale du cerveau et retirez le cerveau. Après la décapitation, transférez rapidement le cerveau dans un bécher rempli d’aLCR oxygéné glacé.
- Préparation de MT-ACC Brain Slice
note: Préparez des tranches qui contiennent le chemin de la MT à l’ACC.
- Coupez à la main le bloc cérébral avec deux coupes sagittales de 2,0 mm latéralement à la ligne médiane dans chaque hémisphère pour afficher l’anatomie sous-corticale. Faites ensuite deux coupes en angle. Faites la première coupe transversale parallèle au faisceau de fibres visibles dans le striatum.
- Effectuez la deuxième coupe transversale de la connexion entre le cervelet et le cortex visuel jusqu’au point médian entre la commissure antérieure et le tractus optique qui sont ventrals et parallèles à la voie thalamo-ingulaire.
- Fixez le bloc cérébral à une plaque angulaire (~120°) avec un adhésif cyanoacrylate et faites une coupe juste au-dessus du point de retournement de la voie. Dépliez la plaque, aplatissez-la et collez-la sur la platine de chambre d’un vibratome.
- Faites des coupes de cerveau thalamus-ACC médial (500 μm d’épaisseur), puis immergez-les dans un aCSF oxygéné glacé. Transférez les tranches dans la chambre d’enregistrement et maintenez-les à 32 °C sous perfusion continue (12 ml/min) avec de l’aCSF oxygéné pendant 1 h.
3. Préparation de la chambre de perfusion pour l’enregistrement par réseau multiélectrodes
- Préparation de la chambre de perfusion
- Placez une sonde MEA sur un système multicanaux et utilisez deux tubes en polyéthylène séparés pour connecter la sonde à une pompe péristaltique. Utilisez un tube pour guider l’aCSF dans la chambre MEA et l’autre tube pour guider l’aCSF hors de la chambre. Enfin, perfuser continuellement la préparation avec de l’aCSF oxygéné chaud (29-30 °C) (8 ml/min).
- Transférez la tranche de cerveau vers MEA. Maintenez la tranche de cerveau sur le MEA à l’aide d’un coton-tige humide. Déplacez soigneusement la tranche de cerveau pour vous assurer que l’ACC est orienté au-dessus des électrodes.
- Utilisez des kits d’ancrage de tranche et des dispositifs de maintien pour appuyer sur la tranche de cerveau. Cette étape assure une bonne connexion électrique entre la tranche et les électrodes.
4. Génération de champs électriques par DCS
Remarque : La définition de l’orientation du champ électrique était basée sur la direction de l’axe axodendritique dans l’ACC. Les orientations des compartiments de dendrite et de soma ont été confirmées à l’aide d’une coloration de Golgi.
- Placez l’électrode AgCl (définie comme l’anode) à proximité de l’ACC et placez l’autre électrode (définie comme la cathode) distale de l’ACC. Enregistrez l’intensité de champ générée par les deux orientations de champ (parallèle et perpendiculaire aux fibres axodendritiques de l’ACC) par le MEA, et délivrez les courants des champs électriques à l’aide d’un stimulateur.
- Fixez la distance entre les électrodes AgCl (environ 1,5-2 cm) et ajustez l'intensité du courant du stimulateur pour que le DCS soit compris entre 0,5 et 2 mA.
5. Réponses synaptiques corticales induites électriquement
Remarque : Induire des réponses synaptiques dans l’ACC par stimulation électrique dans la MT, dans laquelle un générateur de stimulus électrique programmable produit des impulsions de courant biphasiques rectangulaires.
- Répétez la section 3 ci-dessus.
- Placez une électrode de tungstène dans le MT et délivrez des impulsions du stimulateur à la région thalamique des tranches via des électrodes de tungstène bipolaires.
- Utilisez différentes intensités de courant pour déterminer le seuil qui déclenche une réponse ACC. Ici, utilisez une intensité de ±150 μA et une durée de 200 μsec, ce qui a provoqué une réponse maximale de 80 % dans l’ACC dans la plupart des coupes.
- Déplacez l’électrode de tungstène le long de la voie thalamocingulaire (de MT à corps calleux) dans la coupe MT-ACC pour obtenir les profils de réponse optimaux.
- Effectuez 10 à 20 balayages des réponses ACC et utilisez le logiciel pour faire automatiquement la moyenne de tous les ACC évoqués par la stimulation MT. Le résultat est les réponses synaptiques dans l’ACC induites par la stimulation de la MT par la voie MT-ACC.
6. Activité semblable à une crise induite électriquement
Remarque : L’activité convulsive a été induite par l’application de 4-aminopyridine (4-AP ; 250 μM) et de biculline (5 μM). Des études antérieures sur le contrôle du temps ont montré que des réponses maximales et stables apparaissaient 2 à 3 heures après l’application du médicament.
- Répétez la section 5 ci-dessus.
- Ajouter des médicaments à la solution de perfusion. Utilisez 4-AP (250 μM) et bicuculline (5 μM). Mélangez uniformément les médicaments et continuez la perfusion pendant 2-3 heures.
- Pour faciliter l’activité convulsive, maintenez la pompe de perfusion à un débit de perfusion relativement rapide (8 ml/min), ce qui peut également aider à prévenir l’accumulation d’un gradient de pH.
- Placez une électrode de tungstène dans le MT et administrez une stimulation électrique (150 μA, durée 200 μs) pour obtenir des profils de réponse ACC.
- Faites 10 à 20 balayages et faites la moyenne des réponses.
- Remplacez la solution de perfusion par de l’aCSF frais pour éliminer les médicaments. Répétez l’étape 6.5.
7. Test de l’effet de l’ECD sur les réponses corticales évoquées
- Répétez les sections 3 et 4. Assurez-vous que des champs électriques uniformes sont générés en faisant passer des courants entre deux fils d’argent parallèles recouverts d’AgCl qui sont placés à l’intérieur de la chambre MEA. S’il n’y a pas de problème, le DCS reste entre 0,5 et 2 mA.
- Éteignez le DCS et placez une électrode de tungstène pour stimuler le thalamus (±150 μA, durée 200 μsec). Pour obtenir des réponses synaptiques maximales dans l’ACC, faites 10 à 20 balayages et faites la moyenne des réponses.
- Activez simultanément le DCS (intensité DCS de 2 mV/mm) et la stimulation thalamique (350 μA, durée 200 μs). Évaluer les changements d’amplitude de la réponse ACC évoquée par stimulation thalamique pendant la DCS.
- Éteignez le SCD et ajoutez du 4-AP (250 μM) et de la biculline (5 μM) à la solution de perfusion. Attendez ensuite 2-3 heures. Lorsque les médicaments affectent la tranche de cerveau, la tranche produit des réponses de crise corticale.
- Effectuez 10 à 20 balayages des réponses ACC, puis mesurez l’amplitude et la durée des réponses de crise corticale évoquées électriques.
- Après l’étape 7.5, activez simultanément le DCS (intensité DCS de 2 mV/mm) et la stimulation thalamique (150 μA, 200 μs de durée). Évaluez les changements dans l’amplitude et la durée des réponses de crise corticale évoquées lors de l’application de la SCD.
- Remplacez la solution de perfusion par du LCR aC frais pour éliminer les médicaments, et répétez les étapes 7.2 et 7.3.
- Collectez toutes les données d’enregistrement et regroupez-les dans les différentes conditions expérimentales. Évaluer l’amplitude et la durée des réponses aux crises corticales dans différentes conditions expérimentales.
