Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation et culture de tranches organotypiques de l’hippocampe
NOTE : Ce protocole permet la production de tranches organotypiques d’hippocampe. Idéalement, pas plus de trois animaux devraient être euthanasiés et disséqués en une seule séance pour s’assurer que chaque étape est effectuée rapidement et pour éviter de compromettre la qualité des tranches. Utilisez une technique aseptique tout au long du processus.
- Assurez-vous que les étapes suivantes sont prises avant de commencer le protocole de dissection.
- Préparez et filtrez toutes les solutions à l’avance à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
- Conservez les solutions à 4 °C pendant l’entreposage et tout au long de la dissection cérébrale et de la préparation de la tranche d’hippocampe en gardant les récipients de stockage et les boîtes de Pétri sur un dissipateur thermique métallique posé sur de la glace humide en tout temps.
- Autoclave tous les instruments métalliques, bagues et mouchoirs en papier.
- Assurez-vous que tous les instruments et matériaux à utiliser pour chaque étape du protocole sont prêts à l’emploi, disposés à l’avance et pulvérisés avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, laissez-les refroidir et sécher.
- Euthanasier un bébé souris C57BL/6N âgé de 5 à 7 jours par luxation cervicale et essuyer brièvement toute la surface de la peau avec un mouchoir en papier stérile imbibé d’éthanol à 70 %. Séchez la peau en tapotant et décapitez le chiot à l’aide de ciseaux à mayonnaise.
- Coupez la peau du cuir chevelu avec des ciseaux à iris le long de la ligne médiane de la tête, en commençant dans la région occipitale et en terminant près du museau, et rétractez-la latéralement.
- Insérez la pointe des ciseaux Vannas dans le foramen magnum et faites deux petites coupes latérales sur l’os le long des sinus transverses, puis coupez le crâne le long de la ligne médiane jusqu’au bulbe olfactif et faites deux petites coupes perpendiculairement à la ligne médiane dans cette région.
- À l’aide d’une pince incurvée à pointe fine, rétractez les lambeaux d’os latéralement loin de la ligne médiane. Retirez délicatement le cerveau à l’aide d’une petite spatule et transférez-le dans une boîte de Pétri de 90 mm recouverte d’élastomère de silicone contenant un « milieu de dissection ».
note: Le milieu de dissection est la solution saline équilibrée de Gey (5 mg/mL de D-glucose, 1 % de solution antibiotique-antimycotique, 10 000 unités/mL de pénicilline, 10 mg/mL de streptomycine et 25 μg/mL d'amphotéricine B).
- Retirez le cervelet et séparez les hémisphères cérébraux le long de la ligne médiane à l’aide d’une lame de rasoir. À l’aide d’une spatule, transférez les hémisphères cérébraux dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 mm recouverte d’élastomère de silicone remplie d’un milieu de dissection frais et glacé. Si plus d’un animal doit être utilisé au cours d’une même séance, répétez les étapes 1.2 à 1.6.
- Sous un stéréomicroscope, coupez le bulbe olfactif et l’extrémité du cortex frontal avec une lame de rasoir et séparez le cortex cérébral du reste du tissu cérébral à l’aide d’une pince à pointe fine. Cette étape laisse l’hippocampe exposé sur la surface médiale du tissu cortical. À partir de cette étape, utilisez une hotte de culture tissulaire à flux laminaire (stérilisée aux ultraviolets et nettoyée avec une solution d’éthanol à 70 %).
- Appliquez un produit de dissection glacé sur un disque plat en plastique et, à l’aide d’une spatule, positionnez le tissu cérébral sur le disque de manière à ce que la surface médiale du cortex soit tournée vers le haut et que l’axe de l’hippocampe soit perpendiculaire à l’axe de la lame de hachage.
- Retirez le milieu de dissection du disque de hachage autant que possible à l’aide d’une pipette Pasteur à pointe fine.
- Coupez la cervelle en tranches de 400 μm à l’aide d’un hachoir à mouchoir à une vitesse et une force de hachage de 50 %.
note: Cette étape doit être réalisée le plus rapidement possible, car le tissu cérébral n’est pas immergé dans le milieu de dissection.
- Remplacez le milieu de dissection dans la boîte de Pétri recouverte d’élastomère de silicone par le milieu frais glacé.
- Une fois le hachoir à tissus terminé, immergez soigneusement le tissu cérébral dans un milieu de dissection frais et transférez le tissu coupé dans la boîte de Pétri recouverte d’élastomère de silicone de 90 mm à l’aide d’un scalpel à lame droite.
- Sous un stéréomicroscope, séparez soigneusement les tranches corticales à l’aide d’une pince à pointe fine. Pour chaque tranche, inspectez l’hippocampe à la recherche de morphologie et de dommages tissulaires potentiels résultant de la dissection ou du tranchage.
- Séparez l’hippocampe du cortex entorhinal et de la fimbria à l’aide d’une pince à pointe fine et de petits ciseaux Vannas. En règle générale, environ 6 à 8 tranches d’hippocampe sont générées par hémisphère.
- Transférez jusqu’à 6 tranches d’hippocampe dans un insert de culture tissulaire à l’aide d’une pipette Pasteur coupée et placez-la dans une boîte de Pétri de 35 mm. Assurez-vous que les tranches sont espacées de quelques millimètres (cela garantira que chaque tranche peut être imagée individuellement).
- Ajoutez immédiatement du « milieu de croissance » glacé au fond de chaque boîte de Pétri, sous l’insert de culture tissulaire, juste en dessous du haut du bord de l’insert de culture tissulaire.
note: Le milieu de croissance contient 50 % de milieu essentiel minimum Eagle, 25 % de solution saline équilibrée de Hanks, 25 % de sérum de cheval, 5 mg/mL de D-glucose, 2 mmol/L de L-glutamine, 1 % de solution d'antibiotique-antimycosique et 10 mmol/L d'acide HEPES(4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique), titré à pH 7,2 avec de l'hydroxyde de sodium.
- Changez le milieu de culture le lendemain de la dissection et tous les 2 à 3 jours par la suite (utilisez le milieu de culture à 37 °C). Assurez-vous que le milieu de croissance est ajouté suffisamment, mais pas au point qu’il déborde sur la membrane de l’insert de culture tissulaire, ce qui pourrait compromettre la viabilité des tranches de tissu.
- Avant d’être utilisés dans des expériences, conservez les tranches de tissu dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone dans l’air pendant 12 à 14 jours.
2. Préparation des coupes organotypiques de l’hippocampe pour le protocole expérimental de TBI
REMARQUE : Les étapes de cette section, à l'exception de l'imagerie, se déroulent dans un capot de culture de tissus à flux laminaire.
- Insérez les anneaux en acier inoxydable sur mesure dans une plaque à 6 puits (un par puits).
REMARQUES : Les anneaux ont un bord avec une encoche (qui doit se trouver à la position 12 heures) et s'adaptent parfaitement à l'intérieur des puits, tandis que les inserts de culture tissulaire s'insèrent facilement dans ce rebord. Assurez-vous que les anneaux sont lavés avec un désinfectant bactéricide, soigneusement rincés à l’eau purifiée, autoclavés et laissés refroidir à l’avance.
- Remplissez le puits de la plaque à 6 puits avec un « milieu expérimental » préchauffé (37 °C) sans sérum avec de l’iodure de propidium.
note: Le milieu expérimental avec de l'iodure de propidium est composé à 75 % de milieu essentiel minimum Eagle, à 25 % de solution saline équilibrée de Hanks, à 5 mg/mL de D-glucose, à 2 mmol/L de L-glutamine, à 1 % de solution d'antibiotique-antimycosique, à 10 mmol/L d'HEPES et à 4,5 μmol/L d'iodure de propidium, titré à 7,2 avec de l'hydroxyde de sodium.
- Assurez-vous que le niveau moyen n’atteint pas au-dessus de l’encoche de l’anneau. Transférez la plaque à 6 puits avec les anneaux dans l’incubateur pendant 1 h pour vous assurer que le milieu est à 37 °C immédiatement avant le transfert des inserts de culture tissulaire.
- Transférez les inserts de culture tissulaire avec les tranches organotypiques des boîtes de Pétri de 35 mm dans la plaque à 6 puits avec les anneaux et le milieu expérimental avec des pinces.
- Faites un point sur le bord de l'insert en position 3 heures avec un marqueur permanent.
note: Les inserts seront retirés de la plaque à 6 puits au cours de l’expérience. Cette étape facilite le retour de l’insert à sa position d’origine après l’exposition à l’onde de choc et permet de garder facilement une trace de chaque tranche tout au long du protocole.
- Étiquetez chaque plaque de 6 puits avec un nom et une date uniques et faites une carte des puits de chaque plaque, en nommant chaque puits (p. ex., A, B, C, etc.) et chaque tranche de chaque puits (p. ex., 1, 2, 3, etc.), de sorte que chaque tranche ait un identificateur unique (p. ex., A1, A2, A3, etc.).
- Transférez la plaque à 6 puits dans l’incubateur pendant 1 h immédiatement avant l’imagerie pour vous assurer que les tranches sont à 37 °C.
note: Évitez les débordements de milieu ou les bulles d'air sous la membrane de l'insert de culture tissulaire, ce qui pourrait compromettre la viabilité des tranches.
- 1 h après le transfert dans le milieu expérimental, imager chaque coupe individuellement à l’aide d’un microscope à fluorescence (objectif 2X, NA 0,06) équipé d’un filtre d’excitation (BP 535/50 nm) et d’émission (LP 610 nm) approprié pour évaluer l’état de la coupe avant que le protocole de blessure ne soit mis en œuvre.
Notes: Les coupes qui présentent des zones de coloration rouge dense à ce stade doivent être considérées comme présentant une viabilité compromise et doivent être exclues d’une analyse plus approfondie (elles représentent généralement moins de 10 % du nombre total de tranches générées). Assurez-vous que l’imagerie est effectuée séquentiellement et aussi rapidement que possible afin de minimiser le temps que les tranches passent à l’extérieur de l’incubateur (généralement, 6 puits devraient prendre un peu moins de 30 minutes pour imager).
- Gardez le couvercle de la plaque à 6 puits allumé en tout temps. Un peu de condensation peut s’accumuler à l’intérieur du couvercle. Si cela se produit, utilisez brièvement un sèche-cheveux sur le réglage bas.
- Assurez-vous que toutes les conditions d’imagerie sont identiques à des jours différents et entre les expériences.
note: Le but de l’imagerie est de quantifier la fluorescence tissulaire ; Cette étape est donc importante pour assurer la reproductibilité des résultats et permettre la comparaison des données.
3. Immersion et transport des inserts de culture tissulaire avec les tranches organotypiques de l’hippocampe
- Immédiatement après l’imagerie, dans une hotte à flux laminaire, une culture tissulaire est prélevée de la plaque à 6 puits à l’aide d’une pince.
- Transférez délicatement l’insert dans un sac stérile en polyéthylène (3 po x 5 po) prérempli de 20 ml de milieu expérimental chaud (37 °C) fraîchement rempli de 95 % d’oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone.
note: S’assurer que le milieu expérimental enrichi en oxygène et en dioxyde de carbone a été bullé pendant au moins 40 minutes avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone à l’aide d’un barboteur en verre fritté à l’intérieur d’une bouteille Dreschel et transféré dans les sacs stériles en polyéthylène à l’intérieur d’un capuchon de culture tissulaire à flux laminaire à l’aide d’une seringue de 20 mL munie d’un filtre bactérien et d’un tube de remplissage stérile (127 mm). Fermez immédiatement les sacs et transférez-les dans un incubateur à 37 °C pendant au moins 1 h avant le transfert de l’insert de culture tissulaire.
- Assurez-vous que chaque sac stérile est correctement étiqueté (avec l’identification de la plaque et du puits). Répétez cette étape pour chaque insert de culture tissulaire. Excluez soigneusement les bulles d’air lors de la fermeture des sacs stériles (en toute sécurité en tournant le haut des sacs et en appliquant une pince en plastique).
- Remettez les sacs stériles avec les inserts de culture tissulaire et les plaques à 6 puits avec milieu d’expérimentation dans l’incubateur à 37 °C.
- Après 1 h, emballez soigneusement les sacs stériles avec les inserts de culture tissulaire dans des boîtes en plastique à l’intérieur d’une boîte thermorégulée remplie d’eau désionisée à 37 °C pour maintenir les coupes organotypiques à température physiologique tout au long du protocole d’exposition aux ondes de choc.
4. Préparation de l’exposition au tube de choc et à la tranche organotypique de l’hippocampe
- Portez des bottes de protection à embout d’acier, une blouse de laboratoire et des gants lors de la préparation du tube de choc et de l’exposition de l’onde de choc.
- Boulonnez le cadre du support de sac stérile à la bride distale du tube de choc, en vous assurant que le trou central est aligné avec la sortie du tube de choc (à l’aide d’une tige d’obturation).
- Montez deux transducteurs de pression radialement : le capteur 1 dans la partie centrale de la section entraînée et le capteur 2 dans la bride distale du tube d’amortisseur (Figure 1A). Connectez les transducteurs de pression à un oscilloscope via une unité d’alimentation à source de courant.
- Assurez-vous que toutes les soupapes de décharge du tube d’amortisseur et les commandes de débit sont fermées.
- Ouvrez la conduite d’air comprimé externe et chargez l’électrovanne à 2,5 bars.
- Ouvrez la soupape de sécurité de la bouteille d’air comprimé et ouvrez lentement le régulateur de pression pour augmenter la pression à environ 5 bar.
REMARQUE : La pression réglée pour ce régulateur doit être légèrement supérieure à la pression d’éclatement du diaphragme la plus élevée.
- Préparez les membranes en découpant des feuilles de polyester de 23 m d’épaisseur en carrés de 10 x 10 cm2. Préparez les poignées à l’aide de ruban adhésif autoclave et collez-les en haut et en bas de chaque diaphragme.
- Placez une membrane (fente unique de la configuration double culasse - membrane simple) ou deux diaphragmes (les deux fentes de la configuration double culasse - double diaphragme) dans la culasse (Figure 1B).
- Centrez les membranes et fixez-les à l’aide de quatre boulons et écrous M24, en les fixant séquentiellement de manière diagonalement symétrique et en veillant à ce que les membranes soient sans plis.
- Fixez chaque sac stérile individuellement en position verticale sur le cadre du support, en veillant à ce que la surface des inserts de culture tissulaire avec les tranches d’hippocampe organotypiques soit face à la sortie du tube de choc et que l’insert de culture tissulaire soit centré à l’intérieur du sac stérile (Figure 1C). Assurez-vous que le sac stérile est solidement fixé tout autour pour assurer une immobilisation ferme et uniforme.
- Portez des protège-oreilles et des lunettes de sécurité lorsque vous exercez une pression sur le tube de choc. Allumez l’unité d’alimentation de la source de courant et l’oscilloscope pour acquérir les données d’ondes de choc (taux d’acquisition de 50 méga-échantillons/s, durée d’enregistrement 20 ms, 1 million de points) et fermez l’électrovanne.
- À l’aide du bouton de contrôle de débit situé sur le panneau de commande du tube d’amortisseur, pressurisez lentement la section de volume du pilote du tube d’amortisseur pour une configuration à diaphragme unique ou à la fois la section de volume du pilote et la section de double culasse du tube d’amortisseur pour une configuration à double diaphragme.
note: Pour une configuration à membrane unique, la pression d’éclatement ne dépendra que du matériau et de l’épaisseur de la membrane, et la membrane se rompra spontanément une fois que la pression d’éclatement du matériau est atteinte. Pour une configuration à double membrane, la pression d’éclatement dépendra également de la différence de pression de gaz dans le pilote et les chambres de culasse doubles, et pour que les membranes éclatent de manière contrôlée, la soupape de sécurité à double culasse est ouverte manuellement une fois que les pressions cibles sont atteintes.
- Dès que la membrane se rompt (produisant un bruit fort), fermez rapidement le flux d’air comprimé à l’aide du bouton de débit et ouvrez l’électrovanne.
note: Le volume total de la section du pilote peut être modifié par l’insertion de segments d’obturation, ce qui permet d’obtenir une plus large gamme de surpression et de durées de pic d’ondes de choc. La combinaison idéale de paramètres d’ondes de choc doit être suffisante pour causer des lésions tissulaires, mais pas si élevée qu’elle provoque l’insertion d’une culture tissulaire ou une distorsion ou une rupture du sac stérile.
- Exposez chaque sac stérile avec une culture tissulaire, insérez-le dans une seule onde de choc et remettez-le immédiatement dans la boîte thermorégulée avant qu’un nouveau sac stérile ne soit retiré de la boîte et fixé sur le cadre du support. S’assurer que les étapes 4.10 à 4.14 sont exécutées aussi facilement et rapidement que possible (en quelques minutes) pour éviter que le milieu expérimental ne se refroidisse, car des températures inférieures à 37 °C peuvent interférer avec le développement de blessures.
- Une fois que tous les inserts de culture tissulaire ont été exposés à une onde de choc (ou à un protocole fictif), retournez-les dans la plaque d’origine à 6 puits et leur puits respectif (à l’intérieur d’une hotte de culture tissulaire à flux laminaire) et retournez-les dans l’incubateur.
- Conservez la plaque à 6 puits dans l’incubateur avec 5 % de dioxyde de carbone dans l’air à 37 °C jusqu’à ce que l’imagerie soit plus poussée.
- Incluez des commandes fictives pour chaque expérience et l’exposition de l’onde de choc de tranche.
note: Les tranches fictives sont traitées à l’identique des tranches exposées à une onde de choc (scellées dans les sacs stériles avec un milieu expérimental, transportées au laboratoire des tubes de choc dans la même boîte thermorégulée, et suspendues sur le cadre métallique pendant une durée équivalente), mais le tube de choc n’est pas mis à feu.
