Établissement d'un modèle de maladie d'Alzheimer dans le cerveau d'un poisson-zèbre par injection de peptide amyloïde

Résumé

Bhattarai, P., et al. Modélisation de la toxicité et de la neurodégénérescence de l’amyloïde-β42 dans le cerveau du poisson-zèbre adulte. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo montre la procédure d'injection de peptides amyloïdes monomères dans le cerveau antérieur d'un poisson-zèbre adulte pour générer une toxicité amyloïde, imitant les lésions neuronales observées dans la maladie d'Alzheimer

Protocole

1. Préparation du peptide Aβ42

1. Synthétiser des peptides (voir le tableau 1) à l’aide de la chimie standard du 9-fluorométhoxycarbonyle (Fmoc) avec le 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) comme réactif de couplage sur un synthétiseur peptidique automatisé en phase solide. L’échelle de la synthèse était de 100 μmol.
2. Chargez le synthétiseur de peptides automatisé avec 500 mg de résine protégée par Fmoc en tant que phase solide (capacité de charge de 0,2 mmol/g). Chargez les acides aminés dissous protégés par Fmoc à une concentration de 0,5 M dans le volume requis et tel que calculé pour le synthétiseur respectif.
   note: Les calculs sont effectués pour permettre le couplage de chaque acide aminé protégé par Fmoc deux fois avec 5 fois l’excès de chaque bloc de construction à la résine.
3. Dissoudre les réactifs nécessaires à la synthèse des peptides dans le diméthylformamide (DMF). Par exemple, préparez l’activateur, HBTU, à une concentration de 0,48 M, 45 % v/v de N-méthylmorpholine (NMM) (la base) et 5 % v/v d’anhydride acétique (le mélange de coiffage) pour recouvrir les groupes aminés n’ayant pas réagi.
4. Cliver tous les peptides de la résine en mélangeant continuellement le support solide à l’aide d’un agitateur dans un mélange de clivage fraîchement préparé composé d’acide trifluoroacétique (TFA) : triisopropylsilane (TIS) : eau : dithiothréitol (DTT) à 90 (v/v) : 5 (v/v) : 2,5 (v/v) : 2,5 (m/v) pendant 4 h. Utiliser 10 mL pour l’échelle de synthèse de 100 μmol.
5. Faites précipiter le produit clivé en ajoutant le mélange de clivage à 100 mL d’éther diéthylique glacé. Passer à travers une unité de filtration contenant un filtre en polytétrafluoroéthylène (PTFE) avec une taille de pores de 0,45 μm et laver avec 20 mL d’éther diéthylique glacé
.
6. Prélever le peptide filtré du papier filtre et dissoudre 100 mg de peptide précipité dans 5 mL d’eau distillée désionisée : acétonitrile à 1:1.
7. Purifier par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) en phase inverse sur une HPLC semi-préparative équipée d’une colonne poreuse en polystyrène divinylbenzène d’une taille de bille de 10 μm.
   1. Préchauffez la colonne et maintenez-la à 50 °C à l’aide d’un appareil de chauffage de colonne. Prélever toutes les fractions principales à l’aide d’un collecteur de fractions automatisé en appliquant un gradient de 5 % à 100 % de solvant B pendant 25 min à 4 mL/min
      note: Le solvant A contient 0,1 % d’AGF dans l’eau et le solvant B est composé de 0,1 % d’AGF dans l’acétonitrile.
   2. Surveillez le chromatogramme à 220 nm, collectez les pics appropriés et analysez à l’aide de la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS).
8. Confirmez la pureté par chromatographie liquide analytique à ultra-haute pression (UPLC) en phase inverse à 220 nm, en surveillant avec un détecteur ultraviolet (UV) tout en faisant passer l’échantillon dans une colonne analytique C18 (taille de la bille 1,7 μm). Confirmer le produit peptidique par spectrométrie de masse.
   note: L’UPLC est couplé à une spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation (ESI-MS) et à un détecteur quadripolaire en tandem.
9. Lyophilisez les fractions correctes du peptide souhaité dans une fiole à fond rond en appliquant un vide de 0,052 mbar sur une poudre duveteuse. Coupler la pompe à vide à une unité de congélation maintenue à -78 °C. Conserver à -80 °C indéfiniment.
10. Utilisez le peptide lyophilisé pour préparer une solution mère de 1 mM dans un mélange d’acétonitrile, de DMF et d’eau de qualité analytique à 1:1:1 pour les expériences. Cette solution peut être conservée pendant au moins 6 mois, car les peptides ne s’y agrègent pas.

2. Préparation du mélange d’injection

1. Préparez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH,₂PO₄, pH 7,4) pour diluer les peptides lyophilisés.
2. Dissoudre le peptide à une concentration finale de 20 μM dans du PBS. Préparez cette solution fraîche. Bien mélanger et conserver sur glace jusqu’à l’injection. Ne pas dépasser 30 min pour éviter l’agrégation dans la solution.

3. Anesthésie

1. Préparez la solution mère des anesthésiques, le méthanesulfonate d’éthyl-m-aminobenzoate à 0,1 % (MESAB), dans de l’eau de poisson ordinaire provenant du système de circulation. Préparez la solution d’anesthésie à une concentration finale de 0,0025 % (v/v).
2. Retirer le nombre désiré de poissons de leur aquarium dans un contenant de transport contenant 5 L d’eau du système.
3. Remplissez à moitié une boîte de Pétri en plastique (90 mm) avec 40 ml d’anesthésiques. Utilisez ce plat pour les injections.
4. Incuber le poisson dans les anesthésiques jusqu’à ce que le mouvement operculaire ait cessé.

4. Microinjection cérébroventriculaire

1. Préparation de l’appareil d’injection
   1. Préparez les capillaires d’injection de verre à l’aide d’un extracteur d’aiguille avec les paramètres suivants : cycle de chauffage, 537 ; cycle de traction, 250 ; vitesse, 1,5 s ; temps, 80 ms.
   2. Amenez le réglage de la pression sur la source de pression à 25 psi.
   3. Réglez les paramètres du micro-injecteur sur 20 psi pour le maintien et 10 psi pour l’éjection, 2,5 pour la période et 100 ms pour le gating.
   4. Chargez le capillaire en verre avec la solution d’injection. Insérez le capillaire en verre dans le support de micro-injection. Ajustez l’angle d’injection à 45°.
2. Placez un poisson dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de solution anesthésiante.
3. Tenez le poisson avec la pince et orientez-le pour l’injection.
4. Générez une fente à l’aide de la pointe d’une aiguille de 30 G dans le crâne au-dessus du tectum optique où les deux plaques latérales se rencontrent. N’insérez pas l’embout dans le tissu cérébral, cela provoquerait des saignements et des dommages.
5. Insérez le capillaire en verre dans la fente.
   1. N’utilisez que la pointe de l’aiguille et ne pénétrez pas à plus de 1 mm dans le crâne. Continuez à tenir le poisson et insérez l’extrémité du capillaire en verre à travers le site d’incision.
   2. Orientez l’extrémité du capillaire de verre vers le télencéphale à un angle de 45°. Injecter 1 μL de la solution. Le liquide se disperse immédiatement après l’injection.

5. Récupération

1. Remettez le poisson dans un récipient de transport jusqu’à ce qu’il se rétablisse. Raccordez le récipient à l’eau de poisson qui circule régulièrement pour garantir une qualité d’eau optimale.
   note: La récupération devrait normalement prendre 1 minute. Si cela prend plus de temps, le poisson doit être maintenu sous anesthésie pendant une période plus courte (l’expérimentateur doit optimiser cela).

Résultats

Tableau 1 : Séquences peptidiques Aβ42 et TR-Aβ42.

peptide	Séquence peptidique	MW (g/mol)
Aβ42	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	4514.1
TR-Aβ42	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acides aminés protégés par Fmoc	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Allemagne)		Acides aminés à base de Fmoc pour la synthèse de peptides en phase solide (SPPS)
N,N,N,N′,N'-Tétraméthyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)hexafluorophosphate d’uronium (HBTU)	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Allemagne)	RL-1030	activateur
Oxyma	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Allemagne)	RL-1180	Suppresseur de racémisation
N,N-diisopropyléthylamine	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Allemagne)	SOL-003	base
Diméthylformamide	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Allemagne)	SOL-004	solvant
N-méthylmorpholine	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Allemagne	A12158	base
1-hydroxybenzotriazole hydraté (HOBT)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, États-Unis)	157260 ALDRICH	activateur
pipéridine	MERCK KGaA (Darmstadt, Allemagne)	822299	Réactif de déprotection Fmoc
Dichlorméthane (DCM)	MERCK KGaA (Darmstadt, Allemagne)	Référence 106050	solvant
Acide formique (FA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Allemagne)	100264	Composant tampon pour HPLC
Acide trifluoroacétique (TFA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Allemagne)	Référence 808260	Clevage Mélange réactif
Triisopropylsilane(TIS)	MERCK KGaA (Darmstadt, Allemagne)	233781 ALDRICH	Clevage Mélange réactif
Acétonitrile (pour UPLC/LCMS)	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	Référence 34967-1L	solvant
Acétonitrile (pour HPLC)	VWR International Ltd, Angleterre	Référence 83639.32	solvant
Éther diéthylique	VWR International Ltd, Angleterre	Référence 23811.326	Solvant pour la précipitation peptidique
Dithiotritol (DTT)	VWR International Ltd, Angleterre	Référence 0281-25G	Clevage Mélange réactif
TentaGel S RAM Fmoc patinoire résine amide	Rapp Polymere GmbH (Tübingen, Allemagne)	Réf. S30023	Phase solide pour SPPS
Synthèse peptidique Seringues de 5 ml avec filtres inclus	Intavis AG (Cologne, Allemagne)	34.274	Tube de réaction pour SPPS et pour le levage à partir de la phase solide
Filtre en polytétrafluoroéthylène (PTFE)	Sartorius Stedtim (Aubagne, France)	11806-50-N	Filtration des peptides précipités
Filtre à seringue en polyfluorure de vinyle (PVDF)	Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe	KC78.1	Pré-filtrage pour HPLC
Synthétiseur de peptides	Intavis, Cologne, Allemagne	ResPep SL	Synthétiseur automatisé de peptides en phase solide
Alliance de l’eau HPLC	Waters, Milford, Massachusetts, États-Unis	Eaux 2998, Eaux e2695	Chromatographie liquide à haute pression (HPLC) semi-préparative en phase inverse
PolymerX, taille de la bille 10μm, 250x10 mm	Phenomenex Ltd. Allemagne	Référence 00G-4328-N0	Colonne HPLC en polystyrène divinylbenzène poreux
Milli-Q Advantage A10, avec un filtre Milli-Q	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, États-Unis	LCPAK0001	Système de purification de l’eau
Unité de filtration	Sartorius Stedtim (Aubagne, France)	Référence 16307	Unité de filtration pour la précipitation des peptides
UPLC Aquity avec détecteur UV	Waters, Milford, Massachusetts, États-Unis	M09UPA 664M	Ultra HPLC analytique en phase inverse pour LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, taille de la bille 1,7 μm, 50x2,1 mm	Waters, Milford, Massachusetts, États-Unis	186002350	Colonne analytique C18
Détecteur ACQUITY TQ	Waters, Milford, Massachusetts, États-Unis	QBB908	Spectrométrie de masse par ionisation par électronébulisation (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Allemagne	16706, 101542	Lyophiliseur avec pompe à vide
Lecteur de plaques Paradigm	Beckman Coulter
MESAB (méthanesulfonate d’éthyl-m-aminobenzoate)	Sigma-Aldrich	A5040
Pétri	Sarstedt	Référence 821.472
Saline tamponnée au phosphate	Technologies de la vie, GIBCO	Référence 10010-056
aiguille	Becton-Dickinson	305178
Microscope de dissection	Olympus, Leica, Zeiss	Varie selon le fabricant
Pince à épiler Dumont	Instruments de précision mondiaux	501985
Pinces de dissection Gillies	Instruments de précision mondiaux	501265
Capillaires d’injection de verre	Instruments de précision mondiaux	TWF10
PicoBuse	Instruments de précision mondiaux	Référence 5430-12
PicoPump pneumatique	Instruments de précision mondiaux	SYS-PV820
Illuminateur annulaire ; Guide de lumière annulaire	Scientifique Parkland	ILL-RLG